卵泡液中一氧化氮（NO）与精子受精能力的关系

主要目标：

在存在/不存在人类卵泡液 (hFF) 的情况下，将 NO 合成的底物 L-精氨酸添加到精子获能培养基中时，确定可育和不育患者 NOS 表达和蛋白质亚硝基化的变化。

次要目标：

1. 调查 hFF 对精子获能的影响是否与液体中的 NO 水平相关。

2. 确定 hFF 中的 NO 水平与 ART 的临床结果之间的相关性。

   方法

   A. 人群 研究中包括的人群将包括精液捐献者和前往 IVI Murcia 诊所接受体外受精技术辅助生殖治疗的夫妇。

   B. 纳入/排除标准 根据目标，人口和纳入和排除标准可能会有所不同。

   纳入标准 主要目标

   检查可育和不育患者中 NOS 表达以及蛋白质亚硝基化的修饰。 为此，将招募以下团体：

   • 一群有生育能力的男性，例如 IVI Murcia 诊所的精子捐献者；
   • 根据 WHO（2010 年）指南，一组由患者组成的生育能力低下的男性，他们到 IVI Murcia 诊所接受体外受精治疗，并且精子图参数发生了改变。

   为了达到次要目标，将包括接受 IVF 或 ICSI 治疗的夫妇。

   排除标准将被排除接受植入前基因诊断，被诊断为反复流产（20 周前连续流产 3 次或以上）或植入失败（36 岁以下女性在 3 次高质量胚胎移植后未怀孕或在 36 岁以上的女性进行两次胚胎移植后）以及 40 岁以上的女性。

   C. 样本量：

   由于无法获得 NOS 表达的参考值，并且由于前向精子分布的可变性很高，因此已确定要检测到双侧测试中相对于平均值的 20% 的差异，其显着性水平为5% 和 80% 的统计功效，每组需要 41 个精液样本。 估计需要 24 个月才能达到精液样本的数量。

   D. 实验设计和干预 对照组（可育精液捐献者）和实验组（不育男性）的生物医学研究

   干预措施：

   精液样本：将在禁欲2-7天后通过手淫获得。 所有样本都将根据 WHO 指南 (2010) 进行分析。 为避免对参与研究的男性进行不必要的访问，将在他们访问诊所时要求提供精液样本。

   精子将在存在和不存在 hFF 的情况下获能。 在第一组实验中，hFF 将添加 L-精氨酸和 NOS 抑制剂 L-NAME。 在另一组实验中，将检查对获能介质的相同补充，但不使用 hFF。

   一系列技术，如蛋白质印迹、原位亚硝基化和生物素转换分析将用于确定精子中 NOS 表达和蛋白质亚硝基化的任何变化。 Western blot 技术也将用于评估其他获能标记，例如蛋白激酶 A (PKA) 活性、酪氨酸磷酸化和酪氨酸硝化。 将对所有精液样本进行相同的处理，无论它们是来自患者还是来自精液捐献者。 在任何情况下都不会使用这些精液样本进行辅助生殖治疗。

   人类卵泡液样本：

   为了研究卵泡液中 NO 浓度与辅助生殖治疗成功之间的相关性，将在卵母细胞提取过程中获取卵泡液样本。 卵母细胞取出后，这些液体通常会被去除，但在这种情况下，液体将以 2000g 离心 10 分钟，并储存在 -20°C 直至评估。

   NO 浓度将在市售测量系统的帮助下确定。 NO 被迅速氧化成两种稳定的离子，即亚硝酸盐和硝酸盐，可以使用离子选择性电极对其进行测定。 这些电极已经小型化，能够测量低至 30-40 µl 的样品，两种物种的检测限都低至低 µM 范围。

   蛋白质印迹和蛋白质亚硝基化测定将在穆尔西亚大学（兽医学院）的动物生理学实验室内进行。

   需要注意的是，分析卵泡液的唯一目的是在辅助生殖治疗后调查治疗结果与NO水平之间是否存在任何相关性。 在任何情况下都不会根据卵泡液中的 NO 水平做出胚胎移植决定。

   E. 生物样本的收集 本研究将评估精子和卵泡液样本。

   • 样本采集目的 本研究采集的样本仅用于完成研究项目。 将为每个生物样本分配一个代码，该代码独立于患者的 NHC 代码（临床病史数量），并且只有研究团队知道。 Juan Carlos Martínez Soto 博士将负责生物样本的储存和保管。
   • 样本采集方法 只有在患者签署相应的知情同意书后，才能获取生物样本。 精液样本将在禁欲 2-7 天后通过手淫获得。 为避免不必要的转移，样本采集将在患者就诊期间进行。

   卵泡液样本将在为患者将遵循的体外受精治疗执行的卵母细胞提取程序的当天获得。 这种通常被丢弃的液体将仅用于确定 NO 值。

   获得这种卵泡液不会对生殖治疗造成任何额外的风险或不适，因为采用取卵手术来获得卵泡液。

   • 样本识别方法 精液和卵泡液样本的识别方式将允许保护参与者的身份。
   • 样本保存 在 Juan Carlos Martínez Soto 博士的监督下，精液和卵泡液样本将在 -80°C 的男科学实验室（IVI Murcia）的冰箱中储存，直到进一步处理。 送往穆尔西亚大学的样本将由 Carmen Matás Parra 博士保管。 穆尔西亚大学的设施和 IVI 诊所的设施都限制访问，因此样本将始终受到保护。 研究完成后（2019 年 1 月），多余的样本将按照诊所的常规规程销毁。

   F. 数据库 有关样本分析的数据（卵泡液和精液样本）将存储在 IVI Murcia 设施的 Excel 表格中。 有关研究中患者接受的辅助生殖治疗结果的数据将从 IVI 管理系统 (SIVIS) 获得。

   G. 研究变量

   根据研究中的相关性，将区分四类变量：

   主要变量：无水平。

   次要变量：NOS表达、前向精子率、妊娠率、生化妊娠、妊娠演变、着床率、异位妊娠率。

   控制变量：酪氨酸磷酸化（光密度单位）、PKA（光密度单位）、蛋白质亚硝基化（光密度单位）、硝酸盐和亚硝酸盐（微摩尔单位）。

   描述性变量：母亲年龄、父亲年龄、男性病因、女性病因、BMI、吸烟习惯。

   H. 数据分析

   描述性分析：

   研究中收集的数据的统计摘要。 分类数据将显示在频率表和直方图中。 连续值将用平均值、标准偏差和置信区间进行汇总，它们将由四分位数或密度图表示。

   数据的探索性分析将允许评估数据的质量和异常检测。

   同质性分析：

   将比较描述性变量（基线和人口统计学）的均值和比例，以验证研究组的可比性程度。 S 卡方检验将应用于分类变量，假设数据服从正态分布，则对连续变量进行 T 检验。 如果数据不服从正态分布，则应用 Mann-Whitney 检验。

   在发现描述性变量的分布方式在组间存在统计差异的情况下，将它们纳入回归模型，以控制它们对要研究的主要关系的干扰。

   NO表达式的比较：

   为了验证 NO 表达式中比例相关性的假设，将应用 Fisher 检验。

   为了评估可以修改 NO 表达行为的其他协变量的影响，将定义逻辑回归模型。

   至于蛋白质亚硝基化的比较，假设数据服从正态分布，将应用学生 t 检验。 如果不满足正态性假设（通过 Kolmogorov-Smirnof 检验验证），将应用非参数 U-MannWhitney 检验。

   同样，将定义一个线性回归模型，允许评估其他相关变量的影响。

   精液质量评价：

   对于构成开创性质量的变量集，假设数据服从正态分布，将应用 t-Student 检验。 如果不满足正态性假设（通过 Kolmogorov-Smirnof 检验验证），将应用非参数 U-MannWhitney 检验。

   妊娠结局评估：

   对于定义妊娠结果的变量集，将应用 Fisher 检验。

   工作计划：

   整个研究团队的发展阶段和任务分配，以及技术人员的任务分配。 另外指出项目实现的地点/中心。

   该研究的设计以及项目的起草工作由 Carmen Matás Parra 博士和 Juan Carlos Martínez Soto 博士完成。

   组成 IVI Murcia 诊所生殖医学科的妇科医生团队 Jose Landeras 博士、María Nicolás、Laura Fernández 和 Martina Trabalón 将负责将患者和精子捐献者纳入研究，以及直接负责对患者进行的辅助生殖治疗。 此类治疗包括：选择要进行的治疗、卵巢刺激、收集卵母细胞和卵泡液的取卵程序以及胚胎移植。

   胚胎学家 Marta Molla、David Gumbao、Julián Marcos、Beatriz Amorocho 和 Ana Isabel Sanchez 将负责受精实验室的卵母细胞受精过程，以及要移植的胚胎的选择。

   Florentin-Daniel Staicu、Carmen Matás Parra 和 Juan Carlos Martínez Soto 将对精液和卵泡液样本进行分析。 这些分析将在 IVI 穆尔西亚诊所的设施和穆尔西亚大学的实验室中进行。

   Jorge Chavarro 博士将进行流行病学和生物统计学研究。