Relación entre el óxido nítrico (NO) en el líquido folicular y la capacidad de fertilización de los espermatozoides

Objetivo principal:

Determinar cambios en la expresión de NOS y nitrosilación de proteínas en pacientes fértiles e infértiles, al agregar L-Arginina, sustrato para la síntesis de NO, al medio de capacitación espermática en presencia/ausencia de líquido folicular humano (hFF).

Objetivos secundarios:

1. Investigar si los efectos de hFF en la capacitación de los espermatozoides están asociados con los niveles de NO en el fluido.

2. Identificar la correlación entre los niveles de NO en hFF y los resultados clínicos de los ART.

   METODOLOGÍA

   A. Población La población incluida en el estudio estará formada tanto por donantes de semen como por parejas que acudan a la clínica IVI Murcia para un tratamiento de reproducción asistida mediante técnicas de fecundación in vitro.

   B. Criterios de inclusión/exclusión En función de los objetivos, tanto la población como los criterios de inclusión y exclusión pueden variar.

   Criterios de inclusión Objetivo principal

   Examinar las modificaciones en la expresión de NOS así como la nitrosilación de proteínas en pacientes fértiles y subfértiles. Para ello, se reclutarán los siguientes grupos:

   • un grupo de machos fértiles, como los donantes de semen que acuden a la clínica IVI Murcia;
   • grupo de varones subfértiles compuesto por pacientes, que acuden a la clínica IVI Murcia para someterse a un tratamiento de fecundación in vitro y que presentan un parámetro de seminograma alterado, según las directrices de la OMS (2010).

   Para alcanzar los Objetivos Secundarios se incluirán las parejas que se sometan a un tratamiento de FIV o ICSI.

   Criterios de exclusión Serán excluidas las parejas que se sometan a diagnóstico genético preimplantacional, hayan sido diagnosticadas de aborto de repetición (tres o más abortos consecutivos antes de la semana 20) o fallo de implantación (falta de embarazo tras tres transferencias embrionarias con embriones de buena calidad en mujeres menores de 36 años o después de dos transferencias de embriones en mujeres mayores de 36 años), así como mujeres mayores de 40 años.

   C. Tamaño de la muestra:

   Dado que no se dispone de valores de referencia para la expresión de NOS y dado que la variabilidad de la distribución de los espermatozoides progresivos es alta, se ha determinado que para detectar una diferencia del 20% con respecto a la media en una prueba bilateral, con un nivel de significación de 5% y 80% de poder estadístico, serán necesarias 41 muestras de semen por grupo. Se estima un período de 24 meses para alcanzar el número de muestras seminales.

   D. Diseño experimental e intervenciones Estudio de investigación biomédica con grupo control (donantes de semen fértil) y grupo experimental (machos subfértiles)

   Intervenciones:

   Muestras de semen: se obtendrán por masturbación después de 2-7 días de abstinencia sexual. Todas las muestras se analizarán de acuerdo con las directrices de la OMS (2010). Para evitar visitas innecesarias a los hombres incluidos en el estudio, se solicitará la muestra de semen en una de sus visitas a la clínica.

   Los espermatozoides estarán capacitados en presencia y ausencia de hFF. En un primer conjunto de experimentos, el hFF se complementará con L-Arginina y el inhibidor de NOS L-NAME. En otra serie de experimentos se examinarán los mismos suplementos al medio de capacitación, pero sin usar hFF.

   Se utilizará una serie de técnicas como Western blot, nitrosilación in situ y Biotin Switch Assay para determinar cualquier cambio en la expresión de NOS y la nitrosilación de proteínas en los espermatozoides. También se aplicará la técnica de Western blot para evaluar otros marcadores de capacitación como la actividad de la Proteína Quinasa A (PKA), la fosforilación de tirosina y la nitración de tirosina. Se realizará el mismo tratamiento a todas las muestras de semen, independientemente de que provengan de pacientes o de donantes de semen. EN NINGÚN CASO ESTAS MUESTRAS DE SEMEN SERÁN UTILIZADAS PARA REALIZAR UN TRATAMIENTO DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA.

   Muestras de líquido folicular humano:

   Para estudiar la correlación entre la concentración de NO en líquido folicular y el éxito del tratamiento de reproducción asistida, las muestras de líquido folicular se obtendrán durante el procedimiento de recogida de ovocitos. Después de la extracción de ovocitos, estos fluidos normalmente se eliminan, pero en este caso los fluidos se centrifugarán durante 10 minutos a 2000 gy se almacenarán a -20 °C hasta su evaluación.

   La concentración de NO se determinará con la ayuda de un sistema de medición comercialmente disponible. El NO se oxida rápidamente en dos iones estables, a saber, nitrito y nitrato, que pueden analizarse utilizando electrodos selectivos de iones. Estos electrodos se han miniaturizado para poder medir muestras de hasta 30-40 µl con límites de detección de hasta el rango bajo de µM para ambas especies.

   Los ensayos de Western blot y nitrosilación de proteínas se realizarán en el laboratorio de Fisiología Animal de la Universidad de Murcia (Facultad de Veterinaria).

   Cabe señalar que el único objetivo de analizar el líquido folicular es investigar después del tratamiento de reproducción asistida si existe alguna correlación entre el resultado del tratamiento y los niveles de NO. En ningún caso se tomarán decisiones de transferencia de embriones en función de los niveles de NO en el líquido folicular.

   E. Recolección de muestras biológicas En el presente estudio se evaluarán muestras de esperma y líquido folicular.

   • Propósito de la recolección de muestras Las muestras recolectadas en el presente estudio solo se utilizarán para completar el proyecto de investigación. A cada muestra biológica se le asignará un código, que será independiente del código NHC (número de historia clínica) de los pacientes y sólo será conocido por el equipo de investigación. El Dr. Juan Carlos Martínez Soto será el responsable del almacenamiento y custodia de las muestras biológicas.
   • Método de recogida de muestras Las muestras biológicas sólo se obtendrán una vez que el paciente haya firmado el correspondiente consentimiento informado. Las muestras seminales se obtendrán por masturbación después de 2-7 días de abstinencia sexual. Para evitar desplazamientos innecesarios, la recogida de muestras se realizará durante la visita del paciente a la clínica.

   Las muestras de líquido folicular se obtendrán el día del procedimiento de recogida de ovocitos realizado para el tratamiento de fecundación in vitro que seguirán las pacientes. Este fluido, que normalmente se desecha, se utilizará únicamente para determinar los valores de NO.

   La obtención de este líquido folicular no supone ningún riesgo ni molestia adicional a las ocasionadas por el tratamiento de reproducción, ya que para la obtención del líquido folicular se utiliza el procedimiento quirúrgico de recogida de ovocitos.

   • Método de identificación de la muestra Las muestras de semen y líquido folicular serán identificadas de forma que permitan resguardar la identidad de los participantes.
   • Conservación de muestras Tanto las muestras de líquido seminal como folicular se almacenarán en congeladores en el laboratorio de Andrología (IVI Murcia) a -80°C hasta su posterior procesamiento, bajo la supervisión del Dr. Juan Carlos Martínez Soto. Las muestras enviadas a la Universidad de Murcia serán almacenadas por la Dra. Carmen Matás Parra. Tanto las instalaciones de la Universidad de Murcia como las de la clínica IVI tienen un acceso restringido, por lo que las muestras estarán siempre vigiladas. Una vez finalizado el estudio (enero de 2019), las muestras sobrantes serán destruidas siguiendo los protocolos habituales de la clínica.

   F. Base de datos Los datos relativos al análisis de las muestras (muestras de líquido folicular y semen), se almacenarán en tablas de Excel en las instalaciones de IVI Murcia. Los datos sobre los resultados de los tratamientos de reproducción asistida que hayan seguido los pacientes incluidos en el estudio se obtendrán del sistema de gestión de IVI (SIVIS).

   G. Variables de estudio

   Se distinguirán cuatro clases de variables según su relevancia dentro del estudio:

   Variable primaria: NO niveles.

   Variables secundarias: expresión de NOS, tasa de espermatozoides progresivos, tasa de embarazo, embarazo bioquímico, evolución del embarazo, tasa de implantación, tasa de embarazo ectópico.

   Variables de control: fosforilación de tirosina (unidades de densidad óptica), PKA (unidades de densidad óptica), nitrosilación de proteínas (unidades de densidad óptica), nitratos y nitritos (unidades micromolares).

   Variables descriptivas: edad materna, edad paterna, etiología masculina, etiología femenina, IMC, hábito tabáquico.

   H. Análisis de datos

   Análisis descriptivo:

   Resumen estadístico de los datos recogidos en el estudio. Los datos categóricos se presentarán en tablas de frecuencia e histogramas. Los valores continuos se resumirán con la media, desviación estándar e intervalo de confianza, se representarán mediante gráficas de cuartiles o densidades.

   El análisis exploratorio de los datos permitirá evaluar la calidad de los mismos y la detección de anomalías.

   Análisis de homogeneidad:

   Se compararán las medias y proporciones de las variables descriptivas (basales y demográficas) para validar el grado de comparabilidad de los grupos de estudio. Se aplicará la prueba S chi-cuadrado en las variables categóricas y, suponiendo que los datos sigan una distribución normal, una prueba T en las variables continuas. Si los datos no siguen una distribución normal, se aplicaría una prueba de Mann-Whitney.

   En el caso de encontrar variables descriptivas distribuidas de forma que existan diferencias estadísticas entre los grupos, se incluirán en un modelo de regresión, para controlar su interferencia en la relación principal a estudiar.

   Comparación de la expresión NO:

   Para validar una hipótesis de correlación de proporciones en la expresión del NO se aplicará una prueba de Fisher.

   Para evaluar el efecto de otras covariables que pueden modificar el comportamiento de la expresión NO, se definirá un modelo de regresión logística.

   En cuanto a la comparación de la nitrosilación de proteínas, se aplicará una prueba t de Student suponiendo que los datos siguen una distribución normal. Si no se cumple el supuesto de normalidad, verificado por una prueba de Kolmogorov-Smirnof, se aplicaría una prueba no paramétrica U-Mann-Whitney.

   Del mismo modo, se definirá un modelo de regresión lineal que permita evaluar el efecto de otras variables correlacionadas.

   Evaluación de la calidad seminal:

   Para el conjunto de variables que componen la calidad seminal se aplicará una prueba t-Student suponiendo que los datos siguen una distribución normal. Si no se cumple el supuesto de normalidad, verificado por una prueba de Kolmogorov-Smirnof, se aplicaría una prueba no paramétrica U-Mann-Whitney.

   Evaluación de los resultados gestacionales:

   Para el conjunto de variables que definen los resultados de la gestación se aplicará una prueba de Fisher.

   El plan de trabajo:

   Fases de desarrollo y distribución de las tareas de todo el equipo investigador, y las asignaciones previstas para el personal técnico. Indicar además lugar/centro de realización del proyecto.

   El diseño del estudio, así como la redacción del proyecto han sido realizados por los doctores Carmen Matás Parra y Juan Carlos Martínez Soto.

   El equipo de ginecólogos que integran la Unidad de Medicina Reproductiva de la clínica IVI Murcia, el Dr. Jose Landeras, María Nicolás, Laura Fernández y Martina Trabalón, serán los responsables de la inclusión de pacientes y donantes de semen en el estudio, así como de el responsable directo del tratamiento de reproducción asistida realizado a los pacientes. Dicho tratamiento incluye: la elección del tratamiento a realizar, la estimulación ovárica, el procedimiento de recogida de ovocitos para la recogida de ovocitos y líquido folicular, así como la transferencia de embriones.

   Los embriólogos Marta Molla, David Gumbao, Julián Marcos, Beatriz Amorocho y Ana Isabel Sánchez serán los responsables del proceso de fecundación de ovocitos en el laboratorio de fecundación, así como de la selección de los embriones a transferir.

   Florentin-Daniel Staicu, Carmen Matás Parra y Juan Carlos Martínez Soto realizarán los análisis de las muestras de líquido seminal y folicular. Estos análisis se realizarán tanto en las instalaciones de la clínica IVI Murcia como en los laboratorios de la Universidad de Murcia.

   El Dr. Jorge Chavarro realizará los estudios epidemiológicos y bioestadísticos.