A follikuláris folyadékban lévő nitrogén-oxid (NO) és a spermium megtermékenyítő képessége közötti kapcsolat

Fő cél:

Határozza meg a NOS expressziójában és a fehérje nitrozilációjában bekövetkező változásokat fertilis és meddő betegekben, ha humán follicularis folyadék (hFF) jelenlétében/hiányában a spermium kapacitációs közeghez L-arginint, a NO szintézis szubsztrátját adják.

Másodlagos célok:

1. Vizsgálja meg, hogy a hFF spermiumkapacitációra gyakorolt ​​hatása összefügg-e a folyadék NO-szintjével.

2. Határozza meg az összefüggést a hFF NO-szintje és az ART-ek klinikai eredményei között.

   MÓDSZERTAN

   A. Populáció A vizsgálatba bevont populáció spermadonorokat és párokat foglal magában, akik az IVI Murcia klinikán vesznek részt az asszisztált reprodukciós kezelés in vitro megtermékenyítési technikáival.

   B. Bevételi/kizárási kritériumok A céloktól függően mind a populáció, mind a befogadási és kizárási kritériumok eltérőek lehetnek.

   Felvételi kritériumok Fő célkitűzés

   Vizsgálni a NOS expresszió változásait, valamint a fehérje nitrozilációját termékeny és szubfertilis betegekben. Ebből a célból a következő csoportokat toborozzák:

   • termékeny hímek csoportja, például az IVI Murcia klinikán járó spermadonorok;
   • szubfertilis hímek csoportja, amely betegekből áll, akik az IVI Murcia klinikán járnak in vitro megtermékenyítési kezelésre, és akiknél egy megváltozott spermiogram paraméter van a WHO (2010) irányelvei szerint.

   A másodlagos célok elérése érdekében azokat a párokat is bevonják, akik IVF vagy ICSI kezelésen esnek át.

   Kizárási kritériumok Kizárásra kerülnek azok a párok, akiknél preimplantációs genetikai diagnózist végeztek, ismétlődő abortuszt (három vagy több egymást követő abortuszt a 20. hét előtt) vagy beültetési kudarcot (terhesség hiánya három jó minőségű embrióval végzett embrióátültetés után 36 év alatti nőknél, vagy két embrióátültetés után 36 év feletti nőknél), valamint 40 év feletti nőknél.

   C. Minta mérete:

   Mivel a NOS expressziójának referenciaértékei nem állnak rendelkezésre, és mivel a progresszív spermiumok eloszlásának változékonysága nagy, úgy határoztuk meg, hogy egy kétoldalú tesztben 20%-os eltérést kell kimutatni az átlaghoz képest, melynek szignifikancia szintje kb. A statisztikai teljesítmény 5%-a és 80%-a, csoportonként 41 spermamintára lesz szükség. A becslések szerint 24 hónapos időszak éri el az ondóminták számát.

   D. Kísérleti tervezés és beavatkozások Orvosbiológiai kutatás kontrollcsoporttal (termékeny spermadonorok) és kísérleti csoporttal (szubfertilis hímek)

   Beavatkozások:

   Spermaminták: 2-7 napos szexuális absztinencia után önkielégítéssel veszik. Minden mintát a WHO irányelvei szerint (2010) elemeznek. A vizsgálatba bevont férfiak szükségtelen látogatásainak elkerülése érdekében a spermamintát a klinikán tett egyik látogatásuk alkalmával kérik le.

   A hFF jelenlétében és hiányában a spermiumok kapacitálásra kerülnek. A kísérletek első sorozatában a hFF-t L-argininnel és az L-NAME NOS inhibitorral egészítik ki. Egy másik kísérletsorozatban ugyanazokat a kapacitációs közeg kiegészítéseket vizsgáljuk meg, de hFF használata nélkül.

   Egy sor technikát, például Western blot-ot, in situ nitrozilációt és Biotin Switch Assay-t alkalmaznak a NOS expressziójában és a fehérje nitrozilációjában bekövetkezett változások meghatározására a spermiumokban. A Western blot technikát más kapacitációs markerek, például a Protein Kinase A (PKA) aktivitás, a tirozin foszforiláció és a tirozin nitrálás értékelésére is alkalmazni fogják. Ugyanazt a kezelést minden spermamintán elvégzik, függetlenül attól, hogy betegektől vagy spermadonoroktól származnak. SEMMILYEN ESETBEN NEM FELHASZNÁLHATJUK EZEKET A SPERMAMINTÁK SZAPORÍTÁSSEGÍTŐ KEZELÉS VÉGREHAJTÁSÁRA.

   Humán follikuláris folyadék minták:

   A tüszőfolyadék NO-koncentrációja és az asszisztált reprodukciós kezelés eredményessége közötti összefüggés vizsgálata érdekében a tüszőfolyadék-mintákat a petesejtek felvétele során veszik. A petesejtek eltávolítása után ezeket a folyadékokat általában eltávolítják, de ebben az esetben a folyadékokat 10 percig 2000 g-vel centrifugálják, és -20 °C-on tárolják az értékelésig.

   Az NO-koncentráció meghatározása egy kereskedelemben kapható mérőrendszer segítségével történik. A NO gyorsan oxidálódik két stabil ionná, nevezetesen nitritté és nitráttá, amelyeket ionszelektív elektródákkal lehet vizsgálni. Ezeket az elektródákat miniatürizáltuk, hogy 30-40 µl-ig lehessen mérni a mintákat úgy, hogy mindkét fajnál az alacsony µM-os tartományban a detektálási határértékek csökkenjenek.

   A Western blot és a fehérje nitrozilációs vizsgálatokat a Murciai Egyetem (Állatorvostudományi Kar) Állatfiziológiai laboratóriumában végzik.

   Megjegyzendő, hogy a follikuláris folyadék elemzésének egyetlen célja, hogy az asszisztált reprodukciós kezelést követően megvizsgáljuk, van-e összefüggés a kezelés eredménye és a NO-szint között. Az embrióátültetési döntéseket semmilyen körülmények között nem a tüszőfolyadék NO-szintje alapján hozzák meg.

   E. Biológiai minták gyűjtése Jelen tanulmányban spermium- és follikuláris folyadékmintákat értékelünk.

   • A mintagyűjtés célja A jelen tanulmányban gyűjtött mintákat csak a kutatási projekt befejezéséhez használjuk fel. Minden biológiai mintához egy kódot rendelnek, amely független a betegek NHC-kódjától (klinikai anamnézis száma), és csak a kutatócsoport ismeri. Dr. Juan Carlos Martínez Soto lesz a felelős a biológiai minták tárolásáért és megőrzéséért.
   • A mintavétel módszere A biológiai mintákat csak akkor veszik, ha a beteg aláírta a megfelelő tájékoztatáson alapuló beleegyezését. Az ondómintákat 2-7 napos szexuális absztinencia után maszturbálással veszik. A szükségtelen elmozdulások elkerülése érdekében a mintavétel a beteg klinikai látogatása során történik.

   A tüszőfolyadék mintákat a betegek által követett in vitro megtermékenyítési kezeléshez elvégzett petesejtek felvételének napján veszik. Ezt a folyadékot, amelyet általában eldobnak, csak a NO-értékek meghatározására használjuk.

   Ennek a tüszőfolyadéknak a beszerzése nem jelent további kockázatot vagy kényelmetlenséget a reprodukciós kezelés okozta kockázatokhoz képest, mivel a petesejt-felszívás műtéti eljárását alkalmazzák a tüszőfolyadék kinyerésére.

   • A minta azonosításának módszere A sperma és a tüszőfolyadék mintákat olyan módon kell azonosítani, amely lehetővé teszi a résztvevők személyazonosságának megőrzését.
   • Mintakonzerválás Mind az ondó-, mind a tüszőfolyadék-mintákat az Andrológiai Laboratóriumban (IVI Murcia) -80°C-on, Dr. Juan Carlos Martínez Soto felügyelete mellett -80°C-on tárolják a további feldolgozásig. A Murciai Egyetemre küldött mintákat Dr. Carmen Matás Parra fogja tárolni. Mind a Murciai Egyetem, mind az IVI klinika létesítményei korlátozottan látogathatók, ezért a mintákat mindig őrzik. A vizsgálat befejezését követően (2019. január) a többletmintákat a klinika szokásos protokollja szerint megsemmisítjük.

   F. Adatbázis A mintaelemzésre vonatkozó adatokat (tüszőfolyadék és spermaminták) az IVI Murcia létesítményeiben Excel táblázatokban tároljuk. A vizsgálatba bevont betegek által követett asszisztált reprodukciós kezelések eredményeire vonatkozó adatokat az IVI menedzsment rendszerből (SIVIS) szerezzük be.

   G. Változók vizsgálata

   A vizsgálaton belüli relevanciájuk alapján a változók négy osztályát különböztetjük meg:

   Elsődleges változó: NO szintek.

   Másodlagos változók: NOS expresszió, progresszív spermiumok aránya, terhességi arány, biokémiai terhesség, terhesség alakulása, beültetési arány, méhen kívüli terhesség aránya.

   Ellenőrző változók: Tirozin foszforiláció (optikai sűrűségegységek), PKA (optikai sűrűségegységek), fehérje nitroziláció (optikai sűrűségegységek), nitrátok és nitritek (mikromoláris egységek).

   Leíró változók: anyai életkor, apai életkor, férfi etiológia, női etiológia, BMI, dohányzási szokás.

   H. Adatelemzés

   Leíró elemzés:

   A vizsgálat során gyűjtött adatok statisztikai összefoglalása. A kategorikus adatok gyakorisági táblázatokban és hisztogramokban jelennek meg. A folytonos értékeket az átlaggal, a szórással és a konfidenciaintervallummal összegezzük, ezeket kvartilisek vagy sűrűségek grafikonjaival ábrázoljuk.

   Az adatok feltáró elemzése lehetővé teszi az adatok minőségének értékelését és az anomáliák kimutatását.

   A homogenitás elemzése:

   A leíró változók (alap- és demográfiai) átlagait és arányait összehasonlítjuk a vizsgálati csoportok összehasonlíthatóságának igazolására. A kategorikus változókban S khi-négyzet próbát alkalmazunk, és ha az adatok normális eloszlást követnek, a folytonos változókban T-próbát. Ha az adatok nem követnek normális eloszlást, Mann-Whitney tesztet kell alkalmazni.

   Abban az esetben, ha olyan leíró változókat találunk, amelyek úgy vannak elosztva, hogy statisztikai különbségek vannak a csoportok között, azokat egy regressziós modellbe foglaljuk, hogy ellenőrizzük a vizsgálandó fő összefüggésbe való interferenciát.

   A NO kifejezés összehasonlítása:

   A NO-kifejezés arányainak korrelációjára vonatkozó hipotézis igazolására Fisher-tesztet alkalmazunk.

   Az NO expresszió viselkedését módosítani képes egyéb kovariánsok hatásának értékelésére logisztikus regressziós modellt definiálunk.

   Ami a fehérje nitroziláció összehasonlítását illeti, Student-féle t-tesztet alkalmazunk, feltételezve, hogy az adatok normális eloszlást követnek. Ha a normalitási feltételezés nem teljesül, Kolmogorov-Smirnof teszttel igazolva, nem paraméteres U-MannWhitney tesztet kell alkalmazni.

   Ugyanígy egy lineáris regressziós modellt fogunk definiálni, amely lehetővé teszi más korrelált változók hatásának értékelését.

   Az ondó minőségének értékelése:

   A szeminális minőséget alkotó változók halmazára t-Student tesztet alkalmazunk, feltételezve, hogy az adatok normális eloszlást követnek. Ha a normalitási feltételezés nem teljesül, Kolmogorov-Smirnof teszttel igazolva, nem paraméteres U-MannWhitney tesztet kell alkalmazni.

   A terhességi eredmények értékelése:

   A terhességi eredményeket meghatározó változók halmazához Fisher-teszt kerül alkalmazásra.

   Munkaterv:

   A teljes kutatócsoport fejlesztési szakaszai, feladatmegosztása, a műszaki állományra tervezett megbízások. Ezen kívül jelölje meg a projekt megvalósításának helyét / központját.

   A tanulmány tervezését, valamint a projekt kidolgozását Carmen Matás Parra és Juan Carlos Martínez Soto doktorok végezték.

   Az IVI Murcia Klinika Reproduktív Orvostudományi Egységét alkotó nőgyógyászok, Dr. Jose Landeras, María Nicolás, Laura Fernández és Martina Trabalón feladata lesz a betegek és spermadonorok bevonása a vizsgálatba, valamint a betegeken végzett asszisztált reprodukciós kezelésért közvetlenül felelős. Az ilyen kezelés magában foglalja: az elvégzendő kezelés megválasztását, petefészek-stimulációt, petesejtek és follikuláris folyadék összegyűjtésére szolgáló petesejtek felvételét, valamint embriótranszfert.

   Marta Molla, David Gumbao, Julián Marcos, Beatriz Amorocho és Ana Isabel Sanchez embriológusok felelnek majd a megtermékenyítési laboratóriumban a petesejtek megtermékenyítésének folyamatáért, valamint az átültetésre kerülő embriók kiválasztásáért.

   Florentin-Daniel Staicu, Carmen Matás Parra és Juan Carlos Martínez Soto mind az ondó-, mind a follikuláris folyadékminták elemzését végzi majd. Ezeket az elemzéseket az IVI Murcia Klinika létesítményeiben és a Murciai Egyetem laboratóriumaiban is elvégzik.

   Dr. Jorge Chavarro fogja végezni az epidemiológiai és biostatisztikai vizsgálatokat.