Взаимосвязь между оксидом азота (NO) в фолликулярной жидкости и способностью сперматозоидов к оплодотворению

Главная цель:

Определить изменения экспрессии NOS и нитрозилирования белков у фертильных и бесплодных пациенток при добавлении L-аргинина, субстрата для синтеза NO, в среду капацитации сперматозоидов в присутствии/отсутствии фолликулярной жидкости человека (hFF).

Второстепенные цели:

1. Выясните, связаны ли эффекты hFF на капацитацию сперматозоидов с уровнями NO в жидкости.

2. Определите корреляцию между уровнями NO в hFF и клиническими исходами АРТ.

   МЕТОДОЛОГИЯ

   A. Население Население, включенное в исследование, будет включать как доноров спермы, так и пары, посещающие клинику IVI Murcia для лечения вспомогательной репродукции с помощью методов экстракорпорального оплодотворения.

   B. Критерии включения/исключения В зависимости от целей, как совокупность, так и критерии включения и исключения могут различаться.

   Критерии включения Основная цель

   Изучить изменения экспрессии NOS, а также нитрозилирования белков у фертильных и субфертильных пациентов. Для этого будут набраны следующие группы:

   • группа фертильных мужчин, таких как доноры спермы, посещающие клинику IVI Murcia;
   • группа субфертильных мужчин, состоящая из пациентов, которые посещают клинику IVI Murcia для прохождения экстракорпорального оплодотворения и имеют один измененный параметр спермиограммы в соответствии с рекомендациями ВОЗ (2010).

   Для достижения второстепенных целей будут включены пары, которые проходят лечение ЭКО или ИКСИ.

   Критерии исключения Будут исключены пары, прошедшие предимплантационную генетическую диагностику, у которых был диагностирован повторный аборт (три или более последовательных аборта до 20-й недели) или неудачная имплантация (отсутствие беременности после трех переносов эмбрионов с эмбрионами хорошего качества у женщин в возрасте до 36 лет или после двух переносов эмбрионов у женщин старше 36 лет), а также женщин старше 40 лет.

   C. Размер выборки:

   Поскольку эталонные значения для экспрессии NOS недоступны, а вариабельность распределения прогрессирующих сперматозоидов высока, было определено, что для обнаружения разницы в 20% по отношению к среднему значению в двустороннем тесте с уровнем значимости 5% и 80% статистической мощности, потребуется 41 образец спермы на группу. По оценкам, для достижения количества семенных образцов требуется период в 24 месяца.

   D. План эксперимента и вмешательства Биомедицинское исследование с контрольной группой (фертильные доноры спермы) и экспериментальной группой (субфертильные мужчины)

   Вмешательства:

   Образцы спермы: будут получены путем мастурбации после 2-7 дней полового воздержания. Все образцы будут проанализированы в соответствии с рекомендациями ВОЗ (2010 г.). Чтобы избежать ненужных визитов для мужчин, включенных в исследование, образец спермы будет запрошен во время одного из их визитов в клинику.

   Сперматозоиды будут капацитированы в присутствии и в отсутствие hFF. В первой серии экспериментов hFF будет дополнен L-аргинином и ингибитором NOS L-NAME. В другой серии экспериментов будут исследованы те же добавки к среде капацитации, но без использования hFF.

   Ряд методов, таких как вестерн-блоттинг, нитрозилирование in situ и анализ биотинового переключения, будет использоваться для определения любых изменений в экспрессии NOS и нитрозилировании белков в сперматозоидах. Техника вестерн-блоттинга также будет применяться для оценки других маркеров капацитации, таких как активность протеинкиназы А (ПКА), фосфорилирование тирозина и нитрование тирозина. Одинаковая обработка будет проводиться со всеми образцами спермы, независимо от того, получены ли они от пациентов или от доноров спермы. НИ ПРИ КАКИХ ОБСТОЯТЕЛЬСТВАХ ЭТИ ОБРАЗЦЫ СПЕРМЫ НЕ ИСПОЛЬЗУЮТСЯ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЛЕЧЕНИЯ ВСПОМОГАТЕЛЬНОЙ РЕПРОДУКЦИИ.

   Образцы фолликулярной жидкости человека:

   Чтобы изучить взаимосвязь между концентрацией NO в фолликулярной жидкости и успехом вспомогательной репродукции, образцы фолликулярной жидкости будут получены во время процедуры забора ооцитов. После удаления ооцитов эти жидкости обычно удаляются, но в этом случае жидкости центрифугируют в течение 10 минут при 2000g и хранят при -20°C до оценки.

   Концентрация NO будет определяться с помощью имеющейся в продаже измерительной системы. NO быстро окисляется до двух стабильных ионов, а именно нитритов и нитратов, которые можно определить с помощью ионоселективных электродов. Эти электроды были миниатюризированы, чтобы иметь возможность измерять образцы объемом до 30-40 мкл с пределами обнаружения до низкого диапазона мкМ для обоих видов.

   Вестерн-блоттинг и анализ нитрозилирования белков будут проводиться в лаборатории физиологии животных Университета Мурсии (факультет ветеринарной медицины).

   Следует отметить, что единственная цель анализа фолликулярной жидкости состоит в том, чтобы выяснить после процедуры вспомогательной репродукции, существует ли какая-либо корреляция между результатом лечения и уровнями NO. Ни при каких обстоятельствах решения о переносе эмбрионов не будут приниматься на основании уровня NO в фолликулярной жидкости.

   E. Сбор биологических образцов В настоящем исследовании будут оцениваться образцы спермы и фолликулярной жидкости.

   • Цель сбора образцов Образцы, собранные в настоящем исследовании, будут использоваться только для завершения исследовательского проекта. Каждому биологическому образцу будет присвоен код, который не зависит от кода NHC (номера истории болезни) пациентов и будет известен только исследовательской группе. Доктор Хуан Карлос Мартинес Сото будет отвечать за хранение и сохранность биологических образцов.
   • Метод сбора образцов Биологические образцы будут получены только после того, как пациент подпишет соответствующее информированное согласие. Семенные образцы будут получены путем мастурбации после 2-7 дней полового воздержания. Во избежание ненужных перемещений забор проб будет производиться во время визита пациента в клинику.

   Образцы фолликулярной жидкости будут получены в день процедуры забора ооцитов, проводимой для лечения экстракорпорального оплодотворения, которому будут следовать пациенты. Эта жидкость, которую обычно выбрасывают, будет использоваться только для определения значений NO.

   Получение этой фолликулярной жидкости не представляет какого-либо дополнительного риска или дискомфорта по сравнению с теми, которые вызваны лечением репродукции, поскольку для получения фолликулярной жидкости используется хирургическая процедура забора ооцитов.

   • Метод идентификации образцов Образцы спермы и фолликулярной жидкости будут идентифицированы таким образом, чтобы сохранить личность участников.
   • Сохранение образцов Образцы семенной и фолликулярной жидкости будут храниться в морозильных камерах в лаборатории андрологии (IVI Мурсия) при температуре -80°C до дальнейшей обработки под наблюдением доктора Хуана Карлоса Мартинеса Сото. Образцы, отправленные в Университет Мурсии, будут храниться у доктора Кармен Матас Парра. Доступ как в Университет Мурсии, так и в клинику IVI ограничен, поэтому образцы всегда будут под охраной. По завершении исследования (январь 2019 г.) лишние образцы будут уничтожены в соответствии с обычными протоколами клиники.

   F. База данных Данные об анализе образцов (фолликулярной жидкости и образцов спермы) будут храниться в таблицах Excel в помещениях IVI Murcia. Данные о результатах процедур вспомогательной репродукции, которым следовали пациенты, включенные в исследование, будут получены из системы управления IVI (SIVIS).

   G. Переменные исследования

   Четыре класса переменных будут различаться в зависимости от их значимости в рамках исследования:

   Первичная переменная: НЕТ уровней.

   Вторичные переменные: экспрессия NOS, скорость прогрессирования сперматозоидов, частота наступления беременности, биохимическая беременность, развитие беременности, частота имплантации, частота внематочной беременности.

   Контрольные переменные: фосфорилирование тирозина (единицы оптической плотности), PKA (единицы оптической плотности), нитрозилирование белков (единицы оптической плотности), нитраты и нитриты (микромолярные единицы).

   Описательные переменные: возраст матери, возраст отца, мужская этиология, женская этиология, ИМТ, привычка курить.

   Н. Анализ данных

   Описательный анализ:

   Статистическая сводка данных, собранных в ходе исследования. Категориальные данные будут представлены в таблицах частот и гистограммах. Непрерывные значения будут суммированы со средним значением, стандартным отклонением и доверительным интервалом, они будут представлены в виде графиков квартилей или плотностей.

   Исследовательский анализ данных позволит оценить качество данных и обнаружение аномалий.

   Анализ однородности:

   Средние значения и пропорции описательных переменных (исходных и демографических) будут сравниваться для подтверждения степени сопоставимости групп исследования. Критерий хи-квадрат будет применяться к категориальным переменным и, при условии, что данные следуют нормальному распределению, Т-критерий к непрерывным переменным. Если данные не подчиняются нормальному распределению, применяется критерий Манна-Уитни.

   В случае обнаружения описательных переменных, распределенных таким образом, что между группами существуют статистические различия, они будут включены в регрессионную модель, чтобы контролировать их влияние на основное изучаемое отношение.

   Сравнение выражения NO:

   Для проверки гипотезы о корреляции пропорций в выражении NO будет применен критерий Фишера.

   Чтобы оценить влияние других копеременных, которые могут изменить поведение выражения NO, будет определена модель логистической регрессии.

   Что касается сравнения нитрозилирования белков, будет применяться критерий Стьюдента, предполагая, что данные следуют нормальному распределению. Если предположение о нормальности не будет выполнено, что подтверждается критерием Колмогорова-Смирнова, будет применен непараметрический критерий U-Манна-Уитни.

   Таким же образом будет определена модель линейной регрессии, позволяющая оценить влияние других коррелирующих переменных.

   Оценка качества семени:

   Для набора переменных, составляющих исходное качество, будет применяться t-критерий Стьюдента, предполагая, что данные следуют нормальному распределению. Если предположение о нормальности не будет выполнено, что подтверждается критерием Колмогорова-Смирнова, будет применен непараметрический критерий U-Манна-Уитни.

   Оценка исходов беременности:

   Для набора переменных, определяющих результаты беременности, будет применяться критерий Фишера.

   План работы:

   Этапы разработки и распределение задач всего исследовательского коллектива, а также запланированных заданий для технического персонала. Укажите дополнительно место/центр реализации проекта.

   Дизайн исследования, а также составление проекта были выполнены докторами Кармен Матас Парра и Хуаном Карлосом Мартинесом Сото.

   Команда гинекологов, входящих в Отделение репродуктивной медицины клиники IVI в Мурсии, д-р Хосе Ландерас, Мария Николас, Лаура Фернандес и Мартина Трабалон, будет отвечать за включение пациентов и доноров спермы в исследование, а также непосредственная ответственность за лечение пациентов вспомогательной репродукцией. Такое лечение включает в себя: выбор проводимого лечения, стимуляцию яичников, процедуру забора ооцитов и фолликулярной жидкости, а также перенос эмбрионов.

   Эмбриологи Марта Молла, Давид Гумбао, Хулиан Маркос, Беатрис Аморочо и Ана Изабель Санчес будут отвечать за процесс оплодотворения яйцеклеток в лаборатории оплодотворения, а также за отбор эмбрионов для переноса.

   Флорентин-Даниэль Стайку, Кармен Матас Парра и Хуан Карлос Мартинес Сото проведут анализ образцов как семенной, так и фолликулярной жидкости. Эти анализы будут проводиться как в помещениях клиники IVI Murcia, так и в лабораториях Университета Мурсии.

   Доктор Хорхе Чаварро проведет эпидемиологические и биостатистические исследования.