Relatie tussen stikstofoxide (NO) in folliculaire vloeistof en spermabevruchting

Hoofddoel:

Bepaal veranderingen in de NOS-expressie en eiwitnitrosylatie bij vruchtbare en onvruchtbare patiënten, wanneer L-Arginine, het substraat voor NO-synthese, wordt toegevoegd aan het spermacapaciteitsmedium in aanwezigheid/afwezigheid van menselijke folliculaire vloeistof (hFF).

Secundaire doelstellingen:

1. Onderzoek of de effecten van hFF op de capaciteit van het sperma verband houden met NO-niveaus in de vloeistof.

2. Identificeer de correlatie tussen NO-niveaus in hFF en de klinische resultaten van ART's.

   METHODOLOGIE

   A. Populatie De populatie die in de studie wordt opgenomen, zal zowel spermadonoren als paren omvatten die de kliniek IVI Murcia bezoeken voor een behandeling van geassisteerde voortplanting via technieken van in-vitrofertilisatie.

   B. In-/uitsluitingscriteria Afhankelijk van de doelstellingen kunnen zowel de populatie als de in- en uitsluitingscriteria variëren.

   Inclusiecriteria Hoofddoel

   Om de modificaties in de NOS-expressie en de eiwitnitrosylatie bij vruchtbare en subfertiele patiënten te onderzoeken. Hiervoor zullen de volgende groepen worden aangeworven:

   • een groep vruchtbare mannetjes, zoals de spermadonoren die de kliniek IVI Murcia bezoeken;
   • een groep subfertiele mannen bestaande uit patiënten die naar de kliniek IVI Murcia gaan om een ​​in-vitrofertilisatiebehandeling te ondergaan en die volgens de richtlijnen van de WHO (2010) één veranderde spermiogramparameter bezitten.

   Om de Nevendoelen te halen, worden ook paren meegenomen die een IVF- of ICSI-behandeling ondergaan.

   Uitsluitingscriteria Worden uitgesloten paren die pre-implantatie genetische diagnose ondergaan, bij wie de diagnose herhaalde abortus (drie of meer opeenvolgende abortussen vóór week 20) ​​of implantatiefalen (uitblijven van zwangerschap na drie embryotransfers met embryo's van goede kwaliteit bij vrouwen jonger dan 36 jaar of na twee embryotransfers bij vrouwen ouder dan 36 jaar), evenals bij vrouwen ouder dan 40 jaar.

   C. Steekproefgrootte:

   Aangezien referentiewaarden voor NOS-expressie niet beschikbaar zijn en aangezien de variabiliteit van de distributie van progressieve spermatozoa hoog is, is vastgesteld dat om een ​​verschil van 20% ten opzichte van het gemiddelde in een bilaterale test te detecteren, met een significantieniveau van 5% en 80% van het statistische vermogen, 41 spermamonsters per groep zijn nodig. Een periode van 24 maanden wordt geschat om het aantal rudimentaire monsters te bereiken.

   D. Experimentele opzet en interventies Biomedische onderzoeksstudie met controlegroep (vruchtbare spermadonoren) en experimentele groep (subfertiele mannen)

   Interventies:

   Spermamonsters: worden verkregen door masturbatie na 2-7 dagen seksuele onthouding. Alle monsters worden geanalyseerd volgens de richtlijnen van de WHO (2010). Om onnodige bezoeken voor de mannen in de studie te voorkomen, zal het spermamonster worden opgevraagd tijdens een van hun bezoeken aan de kliniek.

   Spermatozoa zullen worden gecapaciteerd in aanwezigheid en afwezigheid van hFF. In een eerste reeks experimenten zal het hFF worden aangevuld met L-Arginine en de NOS-remmer L-NAME. In een andere reeks experimenten zullen dezelfde aanvullingen op het capaciteitsmedium worden onderzocht, maar zonder hFF te gebruiken.

   Een reeks technieken zoals Western blot, in situ nitrosylatie en Biotin Switch Assay zal worden gebruikt om eventuele veranderingen in de NOS-expressie en eiwitnitrosylatie in spermatozoa te bepalen. De Western blot-techniek zal ook worden toegepast om andere capaciteitsmarkers te evalueren, zoals de Protein Kinase A (PKA)-activiteit, tyrosinefosforylering en tyrosinenitratie. Alle spermamonsters zullen dezelfde behandeling ondergaan, ongeacht of ze afkomstig zijn van patiënten of van spermadonoren. IN GEEN GEVAL ZULLEN DEZE SPERMAMONSTERS WORDEN GEBRUIKT OM EEN BEHANDELING VAN GEASSULEERDE VOORTPLANTING UIT TE VOEREN.

   Menselijke folliculaire vloeistofmonsters:

   Om de correlatie tussen de NO-concentratie in het follikelvocht en het succes van de geassisteerde voortplantingsbehandeling te bestuderen, zullen de follikelvochtmonsters worden afgenomen tijdens de eicelpick-upprocedure. Na het verwijderen van de eicel worden deze vloeistoffen normaal gesproken geëlimineerd, maar in dit geval worden de vloeistoffen gedurende 10 minuten bij 2000 g gecentrifugeerd en tot evaluatie bij -20°C bewaard.

   De NO-concentratie wordt bepaald met behulp van een in de handel verkrijgbaar meetsysteem. NO wordt snel geoxideerd tot twee stabiele ionen, namelijk nitriet en nitraat, die kunnen worden getest met behulp van ionenselectieve elektroden. Deze elektroden zijn geminiaturiseerd om monsters tot 30-40 µl te kunnen meten met detectielimieten tot het lage µM-bereik voor beide soorten.

   De Western-blot- en eiwitnitrosyleringsassays zullen worden uitgevoerd in het laboratorium voor dierenfysiologie, aan de Universiteit van Murcia (faculteit Diergeneeskunde).

   Opgemerkt moet worden dat het enige doel van het analyseren van het follikelvocht is om na de geassisteerde voortplantingsbehandeling te onderzoeken of er een verband bestaat tussen het resultaat van de behandeling en de NO-waarden. In geen geval worden beslissingen over embryotransfers genomen op basis van de NO-waarden in het folliculaire vocht.

   E. Verzameling van biologische monsters Sperma- en folliculaire vloeistofmonsters zullen in dit onderzoek worden geëvalueerd.

   • Doel van monsterverzameling De monsters die in dit onderzoek zijn verzameld, zullen alleen worden gebruikt voor de afronding van het onderzoeksproject. Aan elk biologisch staal wordt een code toegekend, die onafhankelijk is van de NHC-code (nummer van de klinische geschiedenis) van de patiënten en alleen bekend is bij het onderzoeksteam. Dr. Juan Carlos Martínez Soto zal verantwoordelijk zijn voor de opslag en bewaring van de biologische monsters.
   • Methode voor monsterafname De biologische monsters worden pas afgenomen nadat de patiënt de bijbehorende geïnformeerde toestemming heeft ondertekend. De zaadmonsters worden verkregen door masturbatie na 2-7 dagen seksuele onthouding. Om onnodige verplaatsingen te voorkomen, vindt de staalafname plaats tijdens het bezoek van de patiënt aan de kliniek.

   De folliculaire vloeistofmonsters worden afgenomen op de dag van de eicelpunctie die wordt uitgevoerd voor de in-vitrofertilisatiebehandeling die de patiënten zullen volgen. Deze vloeistof, die normaal wordt weggegooid, wordt alleen gebruikt om NO-waarden te bepalen.

   Het verkrijgen van dit folliculaire vocht vormt geen extra risico of ongemak voor degenen die worden veroorzaakt door de voortplantingsbehandeling, aangezien de chirurgische procedure van het ophalen van eicellen wordt gebruikt om het folliculaire vocht te verkrijgen.

   • Methode voor monsteridentificatie De sperma- en follikelvloeistofmonsters worden zodanig geïdentificeerd dat de identiteit van de deelnemers kan worden gegarandeerd.
   • Monsterconservering Zowel zaad- als folliculaire vloeistofmonsters zullen worden opgeslagen in vriezers in het laboratorium van Andrologie (IVI Murcia) bij -80°C tot verdere verwerking, onder supervisie van Dr. Juan Carlos Martínez Soto. De monsters die naar de Universiteit van Murcia worden gestuurd, worden bewaard door Dr. Carmen Matás Parra. Zowel de faciliteiten van de Universiteit van Murcia als die van de IVI-kliniek hebben een beperkte toegang, daarom zullen de monsters altijd worden bewaakt. Na voltooiing van het onderzoek (januari 2019) zullen de overtollige monsters worden vernietigd volgens de gebruikelijke protocollen van de kliniek.

   F. Database De gegevens met betrekking tot monsteranalyse (folliculair vocht en spermamonsters) zullen worden opgeslagen in Excel-tabellen in de faciliteiten van IVI Murcia. De gegevens over de resultaten van de geassisteerde voortplantingsbehandelingen die zijn gevolgd door de patiënten die in de studie zijn opgenomen, zullen worden verkregen uit het IVI-managementsysteem (SIVIS).

   G. Bestudeer variabelen

   Er zullen vier klassen van variabelen worden onderscheiden op basis van hun relevantie binnen het onderzoek:

   Primaire variabele: GEEN niveaus.

   Secundaire variabelen: NOS-expressie, snelheid van progressief sperma, zwangerschapspercentage, biochemische zwangerschap, zwangerschapsevolutie, implantatiepercentage, buitenbaarmoederlijke zwangerschapspercentage.

   Controlevariabelen: tyrosinefosforylering (optische dichtheidseenheden), PKA (optische dichtheidseenheden), eiwitnitrosylering (optische dichtheidseenheden), nitraten en nitrieten (micromolaire eenheden).

   Beschrijvende variabelen: leeftijd van moeder, leeftijd van vader, mannelijke etiologie, vrouwelijke etiologie, BMI, rookgewoonte.

   H. Gegevensanalyse

   Beschrijvende analyse:

   Statistische samenvatting van de gegevens die in het onderzoek zijn verzameld. Categorische gegevens worden gepresenteerd in frequentietabellen en histogrammen. De continue waarden worden samengevat met het gemiddelde, de standaarddeviatie en het betrouwbaarheidsinterval, ze worden weergegeven door grafieken van kwartielen of dichtheden.

   De verkennende analyse van de gegevens zal toelaten om de kwaliteit van de gegevens te beoordelen en anomalieën op te sporen.

   Analyse van homogeniteit:

   De gemiddelden en verhoudingen van de beschrijvende variabelen (baseline en demografie) zullen worden vergeleken om de mate van vergelijkbaarheid van de onderzoeksgroepen te valideren. Er wordt een chi-kwadraattoets toegepast in de categorische variabelen en, ervan uitgaande dat de gegevens een normale verdeling volgen, een T-toets in de continue variabelen. Als de gegevens geen normale verdeling volgen, zou een Mann-Whitney-test worden toegepast.

   In het geval van het vinden van beschrijvende variabelen die zodanig zijn verdeeld dat er statistische verschillen tussen de groepen zijn, zullen ze worden opgenomen in een regressiemodel om hun interferentie met de hoofdrelatie die moet worden bestudeerd te controleren.

   Vergelijking van NO-expressie:

   Om een ​​hypothese van correlatie van verhoudingen in de NO-uitdrukking te valideren, zal een Fisher-test worden toegepast.

   Om het effect te evalueren van andere covariabelen die het gedrag van NO-expressie kunnen wijzigen, zal een logistisch regressiemodel worden gedefinieerd.

   Wat betreft de vergelijking van eiwitnitrosylatie, zal een Student's t-test worden toegepast, ervan uitgaande dat de gegevens een normale verdeling volgen. Als niet aan de normaliteitsaanname wordt voldaan, geverifieerd door een Kolmogorov-Smirnof-test, zou een niet-parametrische U-MannWhitney-test worden toegepast.

   Op dezelfde manier zal een lineair regressiemodel worden gedefinieerd dat de evaluatie van het effect van andere gecorreleerde variabelen mogelijk maakt.

   Evaluatie van zaadkwaliteit:

   Voor de reeks variabelen waaruit de rudimentaire kwaliteit bestaat, wordt een t-Student-test toegepast, ervan uitgaande dat de gegevens een normale verdeling volgen. Als niet aan de normaliteitsaanname wordt voldaan, geverifieerd door een Kolmogorov-Smirnof-test, zou een niet-parametrische U-MannWhitney-test worden toegepast.

   Evaluatie van zwangerschapsuitkomsten:

   Voor de set variabelen die de drachtresultaten bepalen, wordt een Fisher-test toegepast.

   Werkplan:

   Ontwikkelingsfasen en verdeling van de taken van het volledige onderzoeksteam, en de geplande opdrachten voor de technische staf. Vermeld daarnaast plaats / centrum van realisatie van het project.

   Het ontwerp van de studie en het opstellen van het project zijn uitgevoerd door de artsen Carmen Matás Parra en Juan Carlos Martínez Soto.

   Het team van gynaecologen dat deel uitmaakt van de afdeling Reproductieve Geneeskunde van de IVI Murcia-kliniek, Dr. Jose Landeras, María Nicolás, Laura Fernández en Martina Trabalón, zal verantwoordelijk zijn voor de opname van patiënten en spermadonors in de studie, evenals de direct verantwoordelijke voor de geassisteerde voortplantingsbehandeling bij patiënten. Een dergelijke behandeling omvat: de keuze van de uit te voeren behandeling, stimulatie van de eierstokken, de procedure voor het ophalen van eicellen om eicellen en folliculair vocht te verzamelen, evenals embryotransfer.

   De embryologen Marta Molla, David Gumbao, Julián Marcos, Beatriz Amorocho en Ana Isabel Sanchez zullen verantwoordelijk zijn voor het proces van eicelbevruchting in het bevruchtingslaboratorium, evenals voor de selectie van terug te plaatsen embryo's.

   Florentin-Daniel Staicu, Carmen Matás Parra en Juan Carlos Martínez Soto zullen de analyse van zowel zaad- als folliculaire vloeistofmonsters uitvoeren. Deze analyses zullen zowel in de faciliteiten van de IVI Murcia-kliniek als in de laboratoria van de Universiteit van Murcia worden uitgevoerd.

   Dr. Jorge Chavarro zal de epidemiologische en biostatistische studies uitvoeren.