卵胞液中の一酸化窒素（NO）と精子受精能の関係

主な目標：

ヒト卵胞液 (hFF) の存在/非存在下で、NO 合成の基質である L-アルギニンを精子受精能獲得培地に添加した場合、肥沃な患者と不妊の患者における NOS 発現とタンパク質ニトロシル化の変化を決定します。

副次的な目的:

1. 精子の受精能獲得に対する hFF の影響が液体中の NO レベルに関連しているかどうかを調査します。

2. hFF の NO レベルと ART の臨床転帰との相関関係を特定します。

   方法論

   A. 母集団 研究に含まれる母集団は、体外受精の技術による生殖補助医療の治療のためにクリニック IVI Murcia に通う精液提供者とカップルの両方で構成されます。

   B. 包含/除外基準 目的に応じて、母集団と包含および除外基準の両方が異なる場合があります。

   採用基準 主な目的

   NOS 発現の変化と、妊娠可能および不妊患者におけるタンパク質のニトロシル化を調べること。 この目的のために、次のグループが募集されます。

   • クリニックIVIムルシアに通う精液提供者などの肥沃な男性のグループ。
   • WHO（2010）のガイドラインによると、体外受精治療を受けるためにクリニックIVIムルシアに通い、1つの変更された精子パラメータを持っている患者で構成される不妊男性のグループ。

   二次目標を達成するために、IVF または ICSI 治療を受けるカップルが含まれます。

   除外基準 着床前遺伝子診断を受け、反復流産（20 週前に 3 回以上の連続流産）または着床不全（36 歳未満の女性で良質の胚を 3 回移植した後の妊娠の欠如）と診断されたカップルは除外されます。 36 歳以上の女性の 2 回の胚移植後）、および 40 歳以上の女性。

   C. サンプルサイズ:

   NOS 発現の参照値が入手できず、進行性精子の分布の変動性が高いため、両側試験で平均値に対して 20% の差を検出することが決定されました。統計的検出力の 5% と 80%、グループごとに 41 の精液サンプルが必要になります。 精液サンプルの数に達するまでに 24 か月かかると推定されます。

   D. 実験計画と介入 対照群（生殖能力のある精液提供者）と実験群（生殖能力の低い男性）を用いた生物医学調査研究

   介入:

   精液サンプル: 性的禁欲の 2-7 日後にマスターベーションによって得られます。 すべてのサンプルは、WHO ガイドライン (2010 年) に従って分析されます。 研究に含まれる男性の不必要な訪問を避けるために、クリニックへの訪問中に精液サンプルが要求されます。

   精子は、hFF の存在下と非存在下で能力を発揮します。 最初の一連の実験では、hFF に L-アルギニンと NOS 阻害剤 L-NAME を追加します。 実験の別のセットでは、キャパシテーション培地への同じ補充が調べられますが、hFF は使用されません。

   ウエスタンブロット、in situ ニトロシル化、ビオチンスイッチアッセイなどの一連の技術を使用して、精子の NOS 発現とタンパク質ニトロシル化の変化を測定します。 ウエスタンブロット技術は、プロテインキナーゼA（PKA）活性、チロシンリン酸化、チロシンニトロ化などの他の容量マーカーを評価するためにも適用されます。 患者から採取したものか、精液提供者から採取したものかに関係なく、すべての精液サンプルに対して同じ処理が行われます。 いかなる場合も、これらの精液サンプルが生殖補助医療の実施に使用されることはありません。

   ヒト卵胞液サンプル:

   卵胞液中のNO濃度と生殖補助医療の成功との相関関係を調べるために、卵母細胞ピックアップ手順中に卵胞液サンプルが取得されます。 卵母細胞の除去後、これらの液体は通常除去されますが、この場合、液体は 2000g で 10 分間遠心分離され、評価まで -20°C で保存されます。

   NO 濃度は、市販の測定システムを使用して決定されます。 NO は 2 つの安定したイオン、すなわち亜硝酸塩と硝酸塩に急速に酸化され、イオン選択電極を使用して分析できます。 これらの電極は小型化されており、サンプルを 30 ～ 40 µl まで測定でき、検出限界は両種とも低 µM 範囲です。

   ウエスタンブロットおよびタンパク質ニトロシル化アッセイは、ムルシア大学（獣医学部）の動物生理学研究所内で実施されます。

   卵胞液を分析する唯一の目的は、生殖補助医療治療の結果と NO レベルとの間に相関関係があるかどうかを調査することであることに注意してください。 いかなる状況においても、卵胞液中のNOレベルに基づいて胚移植の決定が下されることはありません.

   E. 生物学的サンプルの収集 精子および卵胞液サンプルは、本研究で評価されます。

   • サンプル収集の目的 本研究で収集されたサンプルは、研究プロジェクトの完了のためにのみ使用されます。 各生物学的サンプルには、患者の NHC コード (病歴の数) とは独立したコードが割り当てられ、研究チームだけが知ることができます。 Juan Carlos Martínez Soto 博士が生体サンプルの保管と保管を担当します。
   • サンプル採取方法 生体サンプルは、患者が対応するインフォームドコンセントに署名した場合にのみ取得されます。 精液サンプルは、性的禁欲の2-7日後にマスターベーションによって得られます。 不必要な移動を避けるために、患者が診療所を訪れている間にサンプル収集が行われます。

   卵胞液サンプルは、患者が従う体外受精治療のために行われる卵母細胞ピックアップ手順の日に取得されます。 通常は廃棄されるこの液体は、NO 値を決定するためにのみ使用されます。

   この卵胞液の採取は、卵母細胞ピックアップの外科的処置が卵胞液の採取に使用されるため、生殖治療によって引き起こされる追加のリスクや不快感をもたらすことはありません。

   • サンプルの識別方法 精液および卵胞液のサンプルは、参加者の身元を保護できる方法で識別されます。
   • サンプルの保存 精液および卵胞液のサンプルは、Juan Carlos Martínez Soto 博士の監督の下、さらに処理するまで -80°C でアンドロロジー研究所 (IVI ムルシア) の冷凍庫に保存されます。 ムルシア大学に送られたサンプルは、Carmen Matás Parra 博士によって保管されます。 ムルシア大学の施設と IVI クリニックの施設はどちらもアクセスが制限されているため、サンプルは常に保護されます。 研究が完了すると（2019年1月）、余剰サンプルはクリニックの通常のプロトコルに従って破棄されます。

   F. データベース サンプル分析に関するデータ (卵胞液および精液サンプル) は、IVI Murcia の施設内の Excel テーブルに保存されます。 研究に含まれる患者が従った生殖補助医療の結果に関するデータは、IVI管理システム（SIVIS）から取得されます。

   G. 研究変数

   変数の 4 つのクラスは、研究内での関連性に応じて区別されます。

   一次変数: レベルなし。

   二次変数: NOS 発現、進行精子率、妊娠率、生化学的妊娠、妊娠の進化、着床率、異所性妊娠率。

   制御変数: チロシンリン酸化 (光学密度単位)、PKA (光学密度単位)、タンパク質ニトロシル化 (光学密度単位)、硝酸塩および亜硝酸塩 (マイクロモル単位)。

   記述変数: 母親の年齢、父親の年齢、男性の病因、女性の病因、BMI、喫煙習慣。

   H. データ分析

   記述的分析:

   研究で収集されたデータの統計的要約。 カテゴリ データは、頻度表とヒストグラムで表示されます。 連続値は、平均、標準偏差、および信頼区間で要約され、四分位数または密度のグラフで表されます。

   データの探索的分析により、データの品質を評価し、異常を検出することができます。

   均一性の分析:

   記述変数 (ベースラインと人口統計) の平均と比率を比較して、研究グループの比較可能性の程度を検証します。 S カイ 2 乗検定がカテゴリ変数に適用され、データが正規分布に従うと仮定して、連続変数の T 検定が適用されます。 データが正規分布に従わない場合は、Mann-Whitney 検定が適用されます。

   グループ間に統計的な差異があるように分布する記述変数を見つける場合、研究対象の主な関係における干渉を制御するために、それらを回帰モデルに含めます。

   NO 式の比較:

   NO 発現における割合の相関関係の仮説を検証するために、フィッシャー検定が適用されます。

   NO 式の動作を変更できる他の共変数の効果を評価するために、ロジスティック回帰モデルが定義されます。

   タンパク質ニトロシル化の比較に関しては、データが正規分布に従うと仮定して、スチューデントの t 検定が適用されます。 正規性の仮定が満たされない場合、Kolmogorov-Smirnof 検定によって検証され、ノンパラメトリック U-MannWhitney 検定が適用されます。

   同様に、他の相関変数の効果を評価できる線形回帰モデルが定義されます。

   精液の質の評価:

   精液の品質を構成する一連の変数について、データが正規分布に従うと仮定して、t-スチューデント検定が適用されます。 正規性の仮定が満たされない場合、Kolmogorov-Smirnof 検定によって検証され、ノンパラメトリック U-MannWhitney 検定が適用されます。

   妊娠転帰の評価:

   妊娠結果を定義する一連の変数について、フィッシャー検定が適用されます。

   作業計画：

   研究チーム全体の開発段階とタスクの配分、および技術スタッフに計画された割り当て。 さらに、プロジェクトの実現の場所/中心を示します。

   研究の設計とプロジェクトの起草は、医師のカルメン・マタス・パラとフアン・カルロス・マルティネス・ソトによって行われました。

   IVI ムルシア クリニックの生殖医療部門を構成する婦人科医のチームであるホセ ランデラス博士、マリア ニコラス博士、ローラ フェルナンデス博士、マルティナ トラバロン博士は、研究に患者と精液提供者を含める責任があります。患者に行われる生殖補助医療の直接の責任者。 このような治療には、実施する治療の選択、卵巣刺激、卵母細胞および卵胞液を採取するための採卵手順、ならびに胚移植が含まれます。

   発生学者の Marta Molla、David Gumbao、Julián Marcos、Beatriz Amorocho、Ana Isabel Sanchez は、受精実験室での卵母細胞受精のプロセスと、移植する胚の選択を担当します。

   Florentin-Daniel Staicu、Carmen Matás Parra、Juan Carlos Martínez Soto は、精液サンプルと卵胞液サンプルの両方の分析を行います。 これらの分析は、IVI ムルシア クリニックの施設とムルシア大学の研究所の両方で実施さ​​れます。

   Dr. Jorge Chavarro が疫学的および生物統計学的研究を実施します。