Beziehung zwischen Stickoxid (NO) in Follikelflüssigkeit und Spermienbefruchtungsfähigkeit

Hauptziel:

Bestimmen Sie Änderungen in der NOS-Expression und Protein-Nitrosylierung bei fruchtbaren und unfruchtbaren Patienten, wenn Sie L-Arginin, das Substrat für die NO-Synthese, in Anwesenheit/Abwesenheit von menschlicher Follikelflüssigkeit (hFF) zum Spermienkapazitationsmedium hinzufügen.

Sekundäre Ziele:

1. Untersuchen Sie, ob die Wirkungen von hFF auf die Kapazität der Spermien mit den NO-Konzentrationen in der Flüssigkeit zusammenhängen.

2. Identifizieren Sie die Korrelation zwischen NO-Spiegeln in hFF und den klinischen Ergebnissen von ARTs.

   METHODIK

   A. Population Die in die Studie eingeschlossene Population umfasst sowohl Samenspender als auch Paare, die die Klinik IVI Murcia für eine Behandlung der assistierten Reproduktion durch Techniken der In-vitro-Fertilisation besuchen.

   B. Einschluss-/Ausschlusskriterien Je nach Zielsetzung können sowohl die Grundgesamtheit als auch die Ein- und Ausschlusskriterien variieren.

   Einschlusskriterien Hauptziel

   Untersuchung der Modifikationen in der NOS-Expression sowie der Proteinnitrosylierung bei fruchtbaren und subfertilen Patientinnen. Dazu werden folgende Gruppen rekrutiert:

   • eine Gruppe fruchtbarer Männer, wie die Samenspender, die die Klinik IVI Murcia besuchen;
   • eine Gruppe subfertiler Männer, die sich aus Patienten zusammensetzt, die die Klinik IVI Murcia aufsuchen, um sich einer In-vitro-Fertilisationsbehandlung zu unterziehen, und die gemäß den Richtlinien der WHO (2010) einen veränderten Spermiogrammparameter aufweisen.

   Um die sekundären Ziele zu erreichen, werden Paare eingeschlossen, die sich einer IVF- oder ICSI-Behandlung unterziehen.

   Ausschlusskriterien Ausgeschlossen werden Paare, die sich einer genetischen Präimplantationsdiagnostik unterziehen, bei denen ein wiederholter Abort (drei oder mehr aufeinanderfolgende Aborte vor der 20 nach zwei Embryotransfers bei Frauen über 36 Jahren) sowie Frauen über 40 Jahren.

   C. Stichprobengröße:

   Da Referenzwerte für die NOS-Expression nicht verfügbar sind und da die Variabilität der Verteilung progressiver Spermien hoch ist, wurde festgestellt, dass in einem bilateralen Test eine Differenz von 20 % in Bezug auf den Mittelwert mit einem Signifikanzniveau von 5 % und 80 % der statistischen Aussagekraft, 41 Samenproben pro Gruppe sind erforderlich. Um die Zahl der Samenproben zu erreichen, wird ein Zeitraum von 24 Monaten veranschlagt.

   D. Versuchsdesign und Interventionen Biomedizinische Forschungsstudie mit Kontrollgruppe (fruchtbare Samenspender) und Versuchsgruppe (subfertile Männchen)

   Eingriffe:

   Samenproben: werden nach 2-7 Tagen sexueller Abstinenz durch Selbstbefriedigung gewonnen. Alle Proben werden gemäß den WHO-Richtlinien (2010) analysiert. Um unnötige Besuche für die an der Studie teilnehmenden Männer zu vermeiden, wird die Samenprobe während eines ihrer Besuche in der Klinik angefordert.

   Spermatozoen werden in Anwesenheit und Abwesenheit von hFF kapazitiert. In einer ersten Reihe von Experimenten wird das hFF mit L-Arginin und dem NOS-Inhibitor L-NAME ergänzt. In einer anderen Reihe von Experimenten werden die gleichen Zusätze zum Kapazitationsmedium untersucht, jedoch ohne Verwendung von hFF.

   Eine Reihe von Techniken wie Western Blot, In-situ-Nitrosylierung und Biotin-Switch-Assay werden verwendet, um Änderungen in der NOS-Expression und Protein-Nitrosylierung in Spermien zu bestimmen. Die Western-Blot-Technik wird auch angewendet, um andere Kapazitationsmarker wie die Aktivität der Proteinkinase A (PKA), die Tyrosin-Phosphorylierung und die Tyrosin-Nitrierung zu evaluieren. Alle Samenproben werden der gleichen Behandlung unterzogen, unabhängig davon, ob sie von Patienten oder Samenspendern stammen. DIESE SPERMAPROBEN WERDEN IN KEINEM FALL ZUR DURCHFÜHRUNG EINER BEHANDLUNG DER UNTERSTÜTZTEN REPRODUKTION VERWENDET.

   Menschliche Follikelflüssigkeitsproben:

   Um die Korrelation zwischen der NO-Konzentration in der Follikelflüssigkeit und dem Erfolg der Behandlung der assistierten Reproduktion zu untersuchen, werden die Follikelflüssigkeitsproben während der Oozytenentnahme entnommen. Nach der Eizellentnahme werden diese Flüssigkeiten normalerweise entfernt, aber in diesem Fall werden die Flüssigkeiten für 10 Minuten bei 2000 g zentrifugiert und bis zur Auswertung bei -20 °C gelagert.

   Die NO-Konzentration wird mit Hilfe eines handelsüblichen Messsystems bestimmt. NO wird schnell zu zwei stabilen Ionen oxidiert, nämlich Nitrit und Nitrat, die unter Verwendung von ionenselektiven Elektroden untersucht werden können. Diese Elektroden wurden miniaturisiert, um Proben bis zu einer Größe von 30-40 µl mit Nachweisgrenzen bis hinunter in den niedrigen µM-Bereich für beide Spezies messen zu können.

   Die Western-Blot- und Protein-Nitrosylierungs-Assays werden im Labor für Tierphysiologie an der Universität Murcia (Veterinärmedizinische Fakultät) durchgeführt.

   Es sollte beachtet werden, dass das einzige Ziel der Analyse der Follikelflüssigkeit darin besteht, nach der Behandlung der assistierten Reproduktion zu untersuchen, ob eine Korrelation zwischen dem Ergebnis der Behandlung und den NO-Werten besteht. Unter keinen Umständen werden Embryotransferentscheidungen auf der Grundlage des NO-Gehalts in der Follikelflüssigkeit getroffen.

   E. Sammlung von biologischen Proben Sperma- und Follikelflüssigkeitsproben werden in der vorliegenden Studie ausgewertet.

   • Zweck der Probenentnahme Die in der vorliegenden Studie gesammelten Proben werden nur für die Durchführung des Forschungsprojekts verwendet. Jeder biologischen Probe wird ein Code zugeordnet, der unabhängig vom NHC-Code (Anamnesenummer) der Patienten ist und nur dem Forschungsteam bekannt ist. Dr. Juan Carlos Martínez Soto wird für die Lagerung und sichere Aufbewahrung der biologischen Proben verantwortlich sein.
   • Methode der Probenentnahme Die biologischen Proben werden erst entnommen, wenn der Patient die entsprechende Einwilligungserklärung unterschrieben hat. Die Samenproben werden nach 2-7 Tagen sexueller Abstinenz durch Selbstbefriedigung gewonnen. Um unnötige Verlagerungen zu vermeiden, erfolgt die Probenentnahme während des Besuchs des Patienten in der Klinik.

   Die Follikelflüssigkeitsproben werden am Tag der Eizellentnahme entnommen, die für die In-vitro-Fertilisationsbehandlung durchgeführt wird, der die Patientinnen folgen werden. Diese Flüssigkeit, die normalerweise entsorgt wird, wird nur zur Bestimmung der NO-Werte verwendet.

   Die Gewinnung dieser Follikelflüssigkeit stellt kein zusätzliches Risiko oder Unbehagen gegenüber denjenigen dar, die durch die Reproduktionsbehandlung verursacht werden, da das chirurgische Verfahren der Eizellenentnahme zur Gewinnung der Follikelflüssigkeit verwendet wird.

   • Verfahren zur Probenidentifizierung Die Samen- und Follikelflüssigkeitsproben werden so identifiziert, dass die Identität der Teilnehmer gesichert werden kann.
   • Probenaufbewahrung Sowohl Samen- als auch Follikelflüssigkeitsproben werden in Gefrierschränken im Labor für Andrologie (IVI Murcia) bei -80 °C bis zur weiteren Verarbeitung unter der Aufsicht von Dr. Juan Carlos Martínez Soto gelagert. Die an die Universität Murcia gesendeten Proben werden von Dr. Carmen Matás Parra aufbewahrt. Sowohl die Einrichtungen der Universität Murcia als auch die der IVI-Klinik haben einen eingeschränkten Zugang, daher werden die Proben immer bewacht. Nach Abschluss der Studie (Januar 2019) werden die überschüssigen Proben gemäß den üblichen Protokollen der Klinik vernichtet.

   F. Datenbank Die Daten bezüglich der Probenanalyse (Follikelflüssigkeits- und Samenproben) werden in Excel-Tabellen in den Einrichtungen von IVI Murcia gespeichert. Die Daten zu den Ergebnissen der Behandlungen der assistierten Reproduktion, die von den in die Studie eingeschlossenen Patienten durchgeführt wurden, werden aus dem IVI-Managementsystem (SIVIS) bezogen.

   G. Studienvariablen

   Entsprechend ihrer Relevanz innerhalb der Studie werden vier Klassen von Variablen unterschieden:

   Primärvariable: NO-Werte.

   Sekundäre Variablen: NOS-Expression, Rate fortschreitender Spermien, Schwangerschaftsrate, biochemische Schwangerschaft, Schwangerschaftsentwicklung, Implantationsrate, Eileiterschwangerschaftsrate.

   Kontrollvariablen: Tyrosinphosphorylierung (optische Dichteeinheiten), PKA (optische Dichteeinheiten), Proteinnitrosylierung (optische Dichteeinheiten), Nitrate und Nitrite (mikromolare Einheiten).

   Beschreibende Variablen: mütterliches Alter, väterliches Alter, männliche Ätiologie, weibliche Ätiologie, BMI, Rauchgewohnheiten.

   H. Datenanalyse

   Beschreibende Analyse:

   Statistische Zusammenfassung der in der Studie erhobenen Daten. Kategoriale Daten werden in Häufigkeitstabellen und Histogrammen dargestellt. Die kontinuierlichen Werte werden mit dem Mittelwert, der Standardabweichung und dem Konfidenzintervall zusammengefasst, sie werden durch Diagramme von Quartilen oder Dichten dargestellt.

   Die explorative Analyse der Daten wird es ermöglichen, die Qualität der Daten zu beurteilen und Anomalien zu erkennen.

   Analyse der Homogenität:

   Die Mittelwerte und Anteile der beschreibenden Variablen (Baseline und demographisch) werden verglichen, um den Grad der Vergleichbarkeit der Studiengruppen zu validieren. Bei den kategorialen Variablen wird ein S-Chi-Quadrat-Test und bei den kontinuierlichen Variablen ein T-Test angewendet, vorausgesetzt, die Daten folgen einer Normalverteilung. Wenn die Daten keiner Normalverteilung folgen, würde ein Mann-Whitney-Test angewendet werden.

   Wenn deskriptive Variablen gefunden werden, die so verteilt sind, dass es statistische Unterschiede zwischen den Gruppen gibt, werden sie in ein Regressionsmodell aufgenommen, um ihre Interferenz mit der zu untersuchenden Hauptrelation zu kontrollieren.

   Vergleich der NO-Expression:

   Um eine Hypothese der Korrelation von Anteilen im NO-Ausdruck zu validieren, wird ein Fisher-Test angewendet.

   Um die Wirkung anderer Kovariablen zu bewerten, die das Verhalten der NO-Expression modifizieren können, wird ein logistisches Regressionsmodell definiert.

   Für den Vergleich der Proteinnitrosylierung wird ein Student-t-Test unter der Annahme angewendet, dass die Daten einer Normalverteilung folgen. Wenn die Normalitätsannahme nicht erfüllt wird, verifiziert durch einen Kolmogorov-Smirnof-Test, würde ein nichtparametrischer U-MannWhitney-Test angewendet werden.

   Auf die gleiche Weise wird ein lineares Regressionsmodell definiert, das die Bewertung des Einflusses anderer korrelierter Variablen erlaubt.

   Bewertung der Samenqualität:

   Für den Satz von Variablen, die die Samenqualität ausmachen, wird ein t-Student-Test angewendet, wobei angenommen wird, dass die Daten einer Normalverteilung folgen. Wenn die Normalitätsannahme nicht erfüllt wird, verifiziert durch einen Kolmogorov-Smirnof-Test, würde ein nichtparametrischer U-MannWhitney-Test angewendet werden.

   Bewertung der Schwangerschaftsergebnisse:

   Für den Satz von Variablen, die die Trächtigkeitsergebnisse definieren, wird ein Fisher-Test angewendet.

   Arbeitsplan:

   Entwicklungsstufen und Verteilung der Aufgaben des gesamten Forschungsteams und der geplanten Einsätze des technischen Personals. Geben Sie zusätzlich Ort / Zentrum der Realisierung des Projekts an.

   Das Design der Studie sowie die Ausarbeitung des Projekts wurden von den Ärzten Carmen Matás Parra und Juan Carlos Martínez Soto durchgeführt.

   Das Team von Gynäkologen, die die Abteilung für Reproduktionsmedizin der Klinik IVI Murcia bilden, Dr. Jose Landeras, María Nicolás, Laura Fernández und Martina Trabalón, wird für die Aufnahme von Patienten und Samenspendern in die Studie sowie verantwortlich sein der direkte Verantwortliche für die Behandlung der assistierten Reproduktion, die an Patienten durchgeführt wird. Eine solche Behandlung umfasst: die Wahl der durchzuführenden Behandlung, die Stimulation der Eierstöcke, das Verfahren zur Entnahme von Eizellen zur Entnahme von Eizellen und Follikelflüssigkeit sowie den Embryotransfer.

   Die Embryologen Marta Molla, David Gumbao, Julián Marcos, Beatriz Amorocho und Ana Isabel Sanchez werden im Befruchtungslabor für den Prozess der Eizellbefruchtung sowie die Auswahl der zu übertragenden Embryonen verantwortlich sein.

   Florentin-Daniel Staicu, Carmen Matás Parra und Juan Carlos Martínez Soto werden die Analyse von Samen- und Follikelflüssigkeitsproben durchführen. Diese Analysen werden sowohl in den Einrichtungen der Klinik IVI Murcia als auch in den Labors der Universität Murcia durchgeführt.

   Dr. Jorge Chavarro wird die epidemiologischen und biostatistischen Studien durchführen.