Związek między tlenkiem azotu (NO) w płynie pęcherzykowym a zdolnością zapłodnienia plemników

Głowny cel:

Określenie zmian ekspresji NOS i nitrozylacji białek u płodnych i niepłodnych pacjentek po dodaniu L-argininy, substratu do syntezy NO, do ośrodka kapacytującego plemniki w obecności/nieobecności płynu folikularnego (hFF).

Cele drugorzędne:

1. Zbadaj, czy wpływ hFF na pojemność plemników jest związany z poziomami NO w płynie.

2. Zidentyfikuj korelację między poziomami NO w hFF a wynikami klinicznymi ART.

   METODOLOGIA

   A. Populacja Populacja objęta badaniem będzie obejmowała zarówno dawców nasienia, jak i pary zgłaszające się do kliniki IVI Murcia w celu leczenia wspomaganego rozrodu technikami zapłodnienia in vitro.

   B. Kryteria włączenia/wyłączenia W zależności od celów, zarówno populacja, jak i kryteria włączenia i wyłączenia mogą się różnić.

   Kryteria włączenia Główny cel

   Zbadanie modyfikacji ekspresji NOS oraz nitrozylacji białek u płodnych i niepłodnych pacjentek. W tym celu rekrutowane będą następujące grupy:

   • grupa płodnych mężczyzn, takich jak dawcy nasienia uczęszczający do kliniki IVI Murcia;
   • grupa niepłodnych samców złożona z pacjentów, którzy zgłaszają się do kliniki IVI Murcia na zabieg zapłodnienia in vitro i mają jeden zmieniony parametr spermiogramu, zgodnie z wytycznymi WHO (2010).

   Aby osiągnąć cele drugorzędne, zostaną uwzględnione pary, które przejdą zabieg IVF lub ICSI.

   Kryteria wykluczenia Zostaną wykluczone pary, które przechodzą preimplantacyjną diagnostykę genetyczną, u których zdiagnozowano powtarzające się aborcje (trzy lub więcej kolejnych aborcji przed 20. po dwóch transferach zarodków u kobiet powyżej 36 roku życia), a także kobiet powyżej 40 roku życia.

   C. Wielkość próbki:

   Ponieważ wartości referencyjne dla ekspresji NOS nie są dostępne, a zmienność rozmieszczenia plemników progresywnych jest wysoka, ustalono, że aby wykryć różnicę 20% w stosunku do średniej w teście dwustronnym, z poziomem istotności 5% i 80% mocy statystycznej, konieczne będzie pobranie 41 próbek nasienia na grupę. Szacuje się, że okres 24 miesięcy osiągnie liczbę próbek nasienia.

   D. Projekt eksperymentu i interwencje Biomedyczne badanie badawcze z grupą kontrolną (płodni dawcy nasienia) i grupą eksperymentalną (samce z obniżoną płodnością)

   Interwencje:

   Próbki nasienia: zostaną pozyskane poprzez masturbację po 2-7 dniach abstynencji seksualnej. Wszystkie próbki będą analizowane zgodnie z wytycznymi WHO (2010). Aby uniknąć niepotrzebnych wizyt mężczyzn objętych badaniem, pobranie nasienia zostanie pobrane podczas jednej z ich wizyt w klinice.

   Plemniki będą kapacytowane w obecności i nieobecności hFF. W pierwszym zestawie eksperymentów hFF zostanie uzupełniony o L-argininę i inhibitor NOS L-NAME. W innym zestawie eksperymentów zostaną zbadane te same dodatki do ośrodka pojemnościowego, ale bez użycia hFF.

   Szereg technik, takich jak Western blot, nitrozylacja in situ i test przełączania biotyny, zostanie wykorzystany do określenia wszelkich zmian w ekspresji NOS i nitrozylacji białek w plemnikach. Technika Western blot zostanie również zastosowana do oceny innych markerów kapacytacji, takich jak aktywność kinazy białkowej A (PKA), fosforylacja tyrozyny i nitrowanie tyrozyny. Takie samo traktowanie zostanie przeprowadzone na wszystkich próbkach nasienia, niezależnie od tego, czy pochodzą one od pacjentów, czy od dawców nasienia. W ŻADNYM PRZYPADKU TE PRÓBKI NASIENIA NIE BĘDĄ WYKORZYSTYWANE DO WYKONYWANIA ZABIEGU ROZRODU WSPOMAGANEGO.

   Próbki ludzkiego płynu pęcherzykowego:

   Aby zbadać korelację między stężeniem NO w płynie pęcherzykowym a powodzeniem leczenia wspomaganego rozrodu, próbki płynu pęcherzykowego zostaną pobrane podczas procedury pobierania oocytów. Po usunięciu oocytów płyny te są zwykle eliminowane, ale w tym przypadku płyny będą wirowane przez 10 minut przy 2000 g i przechowywane w temperaturze -20°C do czasu oceny.

   Stężenie NO będzie oznaczane za pomocą dostępnego w handlu systemu pomiarowego. NO jest szybko utleniany do dwóch stabilnych jonów, mianowicie azotynów i azotanów, które można oznaczyć za pomocą elektrod jonoselektywnych. Elektrody te zostały zminiaturyzowane, aby móc mierzyć próbki do 30-40 µl z granicami wykrywalności do niskiego zakresu µM dla obu gatunków.

   Testy Western blot i nitrozylacji białek zostaną przeprowadzone w laboratorium Animal Physiology na Uniwersytecie w Murcji (Wydział Medycyny Weterynaryjnej).

   Należy zaznaczyć, że jedynym celem analizy płynu pęcherzykowego jest zbadanie, czy po zabiegu wspomaganego rozrodu istnieje korelacja między wynikiem zabiegu a stężeniem NO. W żadnym wypadku decyzje o transferze zarodków nie będą podejmowane na podstawie poziomu NO w płynie pęcherzykowym.

   E. Pobieranie próbek biologicznych Próbki nasienia i płynu pęcherzykowego zostaną ocenione w niniejszym badaniu.

   • Cel pobrania próbek Próbki pobrane w ramach niniejszego badania posłużą jedynie do realizacji projektu badawczego. Każdej próbce biologicznej zostanie nadany kod, który będzie niezależny od kodu NHC (numer historii klinicznej) pacjentów i będzie znany tylko zespołowi badawczemu. Dr Juan Carlos Martínez Soto będzie odpowiedzialny za przechowywanie i zabezpieczanie próbek biologicznych.
   • Metoda pobierania próbek Próbki biologiczne będą pobierane dopiero po podpisaniu przez pacjenta odpowiedniej świadomej zgody. Próbki nasienia będą pobierane przez masturbację po 2-7 dniach abstynencji seksualnej. Aby uniknąć niepotrzebnych przesunięć, pobranie próbki odbędzie się podczas wizyty pacjenta w poradni.

   Próbki płynu pęcherzykowego zostaną pobrane w dniu pobrania komórek jajowych do zabiegu zapłodnienia pozaustrojowego, którym będą objęte pacjentki. Ten płyn, który jest zwykle usuwany, będzie używany tylko do oznaczania wartości NO.

   Pobranie tego płynu pęcherzykowego nie wiąże się z dodatkowym ryzykiem ani dyskomfortem w stosunku do tych, jakie niesie ze sobą zabieg rozrodczy, ponieważ do pozyskania płynu pęcherzykowego stosuje się zabieg chirurgiczny pobrania oocytu.

   • Metoda identyfikacji próbki Próbki nasienia i płynu pęcherzykowego będą identyfikowane w sposób pozwalający na zabezpieczenie tożsamości uczestników.
   • Konserwacja próbek Zarówno próbki nasienia, jak i płynu pęcherzykowego będą przechowywane w zamrażarkach w laboratorium Andrologii (IVI Murcia) w temperaturze -80°C do czasu dalszej obróbki, pod nadzorem dr Juana Carlosa Martíneza Soto. Próbki przesłane do Uniwersytetu w Murcji będą przechowywane przez dr Carmen Matás Parra. Zarówno obiekty Uniwersytetu w Murcji, jak i kliniki IVI mają ograniczony dostęp, dlatego próbki będą zawsze strzeżone. Po zakończeniu badania (styczeń 2019 r.) nadwyżki próbek zostaną zniszczone zgodnie ze zwykłymi protokołami kliniki.

   F. Baza danych Dane dotyczące analizy próbek (płyn pęcherzykowy i próbki nasienia) będą przechowywane w tabelach Excel w obiektach IVI Murcia. Dane dotyczące wyników zabiegów wspomaganego rozrodu, którym poddały się pacjentki objęte badaniem, będą pozyskiwane z systemu zarządzania IVI (SIVIS).

   G. Badanie zmiennych

   Zostaną wyróżnione cztery klasy zmiennych w zależności od ich istotności w ramach badania:

   Zmienna podstawowa: poziomy NO.

   Zmienne drugorzędowe: Ekspresja NOS, odsetek postępujących plemników, wskaźnik ciąż, ciąża biochemiczna, ewolucja ciąż, wskaźnik implantacji, wskaźnik ciąż pozamacicznych.

   Zmienne kontrolne: fosforylacja tyrozyny (jednostki gęstości optycznej), PKA (jednostki gęstości optycznej), nitrozylacja białka (jednostki gęstości optycznej), azotany i azotyny (jednostki mikromolowe).

   Zmienne opisowe: wiek matki, wiek ojca, etiologia męska, etiologia żeńska, BMI, nałóg palenia.

   H. Analiza danych

   Analiza opisowa:

   Statystyczne zestawienie danych zebranych w badaniu. Dane kategoryczne zostaną przedstawione w postaci tabel częstotliwości i histogramów. Wartości ciągłe zostaną podsumowane za pomocą średniej, odchylenia standardowego i przedziału ufności, będą reprezentowane przez wykresy kwartyli lub gęstości.

   Eksploracyjna analiza danych pozwoli na ocenę jakości danych oraz wykrycie nieprawidłowości.

   Analiza jednorodności:

   Średnie i proporcje zmiennych opisowych (wyjściowych i demograficznych) zostaną porównane w celu sprawdzenia stopnia porównywalności badanych grup. Test schi-kwadrat zostanie zastosowany w przypadku zmiennych kategorialnych, a zakładając, że dane mają rozkład normalny, zostanie zastosowany test t w przypadku zmiennych ciągłych. Jeśli dane nie mają rozkładu normalnego, zostanie zastosowany test Manna-Whitneya.

   W przypadku znalezienia zmiennych opisowych rozłożonych w taki sposób, że występują różnice statystyczne między grupami, zostaną one włączone do modelu regresji, aby kontrolować ich interferencję w głównej relacji, która ma być badana.

   Porównanie wyrażenia NO:

   Aby zweryfikować hipotezę korelacji proporcji w wyrażeniu NO, zastosowany zostanie test Fishera.

   Aby ocenić wpływ innych zmiennych towarzyszących, które mogą modyfikować zachowanie ekspresji NO, zostanie zdefiniowany model regresji logistycznej.

   Jeśli chodzi o porównanie nitrozylacji białek, zostanie zastosowany test t-Studenta przy założeniu, że dane mają rozkład normalny. Jeżeli założenie o normalności nie będzie spełnione, zweryfikowane testem Kołmogorowa-Smirnofa, zastosowany zostanie nieparametryczny test U-Manna-Whitneya.

   W ten sam sposób zostanie zdefiniowany model regresji liniowej, który pozwala na ocenę wpływu innych skorelowanych zmiennych.

   Ocena jakości nasienia:

   Dla zestawu zmiennych składających się na jakość nasienia zastosowany zostanie test t-Studenta przy założeniu, że dane mają rozkład normalny. Jeżeli założenie o normalności nie będzie spełnione, zweryfikowane testem Kołmogorowa-Smirnofa, zastosowany zostanie nieparametryczny test U-Manna-Whitneya.

   Ocena wyników ciąży:

   Dla zbioru zmiennych definiujących wyniki ciąży zastosowany zostanie test Fishera.

   Plan pracy:

   Etapy rozwoju i podział zadań całego zespołu badawczego oraz zadania zaplanowane dla personelu technicznego. Wskaż dodatkowo miejsce/centrum realizacji projektu.

   Projekt badania, a także szkic projektu wykonali lekarze Carmen Matás Parra i Juan Carlos Martínez Soto.

   Zespół ginekologów tworzących Oddział Medycyny Rozrodu w klinice IVI Murcia, dr Jose Landeras, María Nicolás, Laura Fernández i Martina Trabalón, będzie odpowiedzialny za włączenie do badania pacjentek i dawców nasienia, a także bezpośrednio odpowiedzialny za zabiegi wspomaganego rozrodu przeprowadzane na pacjentach. Takie leczenie obejmuje: wybór zabiegu do wykonania, stymulację jajników, zabieg pobrania oocytów w celu pobrania oocytów i płynu pęcherzykowego oraz transfer zarodka.

   Embriolodzy Marta Molla, David Gumbao, Julián Marcos, Beatriz Amorocho i Ana Isabel Sanchez będą odpowiedzialni za proces zapłodnienia komórki jajowej w laboratorium zapłodnienia, a także selekcję zarodków do transferu.

   Florentin-Daniel Staicu, Carmen Matás Parra i Juan Carlos Martínez Soto przeprowadzą analizę zarówno próbek nasienia, jak i płynu pęcherzykowego. Analizy te będą przeprowadzane zarówno w obiektach kliniki IVI Murcia, jak iw laboratoriach Uniwersytetu w Murcji.

   Badania epidemiologiczne i biostatystyczne przeprowadzi dr Jorge Chavarro.