Förhållandet mellan kväveoxid (NO) i follikulär vätska och spermiebefruktningsförmåga

Huvudmål:

Bestäm förändringar i NOS-uttrycket och proteinnitrosylering hos fertila och infertila patienter, när L-arginin, substratet för NO-syntes, tillsätts till spermiekapaciteringsmediet i närvaro/avsaknad av human follikulär vätska (hFF).

Sekundära mål:

1. Undersök om effekterna av hFF på spermiekapaciteten är associerade med NO-nivåer i vätskan.

2. Identifiera korrelationen mellan NO-nivåer i hFF och de kliniska resultaten från ART.

   METODIK

   A. Population Populationen som ingår i studien kommer att bestå av både spermadonatorer och par som går på kliniken IVI Murcia för behandling av assisterad befruktning via tekniker för in vitro fertilisering.

   B. Inklusions-/exklusionskriterier Beroende på målen kan både populationen och inklusions- och exkluderingskriterierna variera.

   Inklusionskriterier Huvudmål

   Att undersöka modifieringarna i NOS-uttrycket samt proteinnitrosyleringen hos fertila och subfertila patienter. För detta ändamål kommer följande grupper att rekryteras:

   • en grupp fertila män, såsom spermadonatorer som besöker kliniken IVI Murcia;
   • en grupp subfertila män som består av patienter, som går på kliniken IVI Murcia för att genomgå en provrörsbefruktningsbehandling och som har en förändrad spermiogramparameter, enligt WHO:s (2010) riktlinjer.

   För att nå de sekundära målen kommer par som genomgår en IVF- eller ICSI-behandling att inkluderas.

   Exklusionskriterier Kommer att uteslutas par som genomgår preimplantationsgenetisk diagnos, diagnostiserats med upprepad abort (tre eller fler på varandra följande aborter före vecka 20) eller implantationssvikt (brist på graviditet efter tre embryoöverföringar med embryon av god kvalitet hos kvinnor under 36 år eller efter två embryoöverföringar hos kvinnor över 36 år), samt kvinnor över 40 år.

   C. Provstorlek:

   Eftersom referensvärden för NOS-uttryck inte är tillgängliga och eftersom variationen i fördelningen av progressiva spermier är hög, har det fastställts att för att detektera en skillnad på 20 % med avseende på medelvärdet i ett bilateralt test, med en signifikansnivå på 5 % och 80 % av statistisk styrka, 41 spermaprover per grupp kommer att behövas. En period på 24 månader beräknas nå antalet sädesprover.

   D. Experimentell design och interventioner Biomedicinsk forskningsstudie med kontrollgrupp (fertila spermadonatorer) och experimentgrupp (subfertila män)

   Interventioner:

   Spermaprover: kommer att erhållas genom onani efter 2-7 dagars sexuell avhållsamhet. Alla prover kommer att analyseras enligt WHO:s riktlinjer (2010). För att undvika onödiga besök för de män som ingår i studien kommer spermaprovet att begäras ut under ett av deras besök på kliniken.

   Spermatozoer kommer att kapaciteras i närvaro och frånvaro av hFF. I en första uppsättning experiment kommer hFF att kompletteras med L-Arginin och NOS-hämmaren L-NAME. I en annan uppsättning experiment kommer samma tillägg till kapacitationsmediet att undersökas, men utan att använda hFF.

   En serie tekniker som Western blot, in situ nitrosylering och Biotin Switch Assay kommer att användas för att bestämma eventuella förändringar i NOS-uttrycket och proteinnitrosylering i spermier. Western blot-tekniken kommer också att användas för att utvärdera andra kapacitationsmarkörer som proteinkinas A (PKA) aktivitet, tyrosinfosforylering och tyrosinnitrering. Samma behandling kommer att utföras på alla spermaprover oavsett om de kommer från patienter eller från spermadonatorer. UNDER INGA FALL KOMMER DESSA SPEDNINGSPROVER ANVÄNDAS FÖR ATT UTFÖRA EN ASSISTERAD REPRODUKTIONSBEHANDLING.

   Mänskliga follikulära vätskeprover:

   För att studera sambandet mellan NO-koncentrationen i follikulär vätska och framgången med den assisterade reproduktionsbehandlingen, kommer follikulära vätskeproverna att tas under oocytupptagningsproceduren. Efter avlägsnande av oocyter elimineras dessa vätskor normalt, men i detta fall kommer vätskorna att centrifugeras i 10 minuter vid 2000g och förvaras vid -20°C fram till utvärdering.

   NO-koncentrationen kommer att bestämmas med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt mätsystem. NO oxideras snabbt till två stabila joner, nämligen nitrit och nitrat, som kan analyseras med jonselektiva elektroder. Dessa elektroder har miniatyriserats för att kunna mäta prover ner till 30-40 µl med detektionsgränser ner till det låga µM-intervallet för båda arterna.

   Western blot- och proteinnitrosyleringsanalyser kommer att utföras i Animal Physiology-laboratoriet vid University of Murcia (fakulteten för veterinärmedicin).

   Det bör noteras att det enda syftet med att analysera follikelvätskan är att efter behandlingen med assisterad befruktning undersöka om det finns någon korrelation mellan resultatet av behandlingen och NO-nivåerna. Under inga omständigheter kommer beslut om embryoöverföring att fattas baserat på NO-nivåerna i follikelvätskan.

   E. Insamling av biologiska prover Sperma- och follikelvätskeprover kommer att utvärderas i denna studie.

   • Syftet med provinsamlingen De prover som samlas in i denna studie kommer endast att användas för slutförandet av forskningsprojektet. Till varje biologiskt prov kommer en kod att tilldelas, som kommer att vara oberoende av NHC-koden (antal klinisk historia) för patienterna och kommer endast att vara känd av forskargruppen. Dr. Juan Carlos Martínez Soto kommer att ansvara för lagring och förvaring av de biologiska proverna.
   • Metod för provtagning De biologiska proverna erhålls först när patienten har skrivit under motsvarande informerat samtycke. Sädesproven kommer att erhållas genom onani efter 2-7 dagars sexuell avhållsamhet. För att undvika onödiga förskjutningar kommer provtagningen att ske under patientens besök på kliniken.

   Follikelvätskeproverna kommer att tas på dagen för oocytupptagningsprocedur som utförs för den provrörsbefruktningsbehandling som patienterna kommer att följa. Denna vätska, som normalt kasseras, kommer endast att användas för att bestämma NO-värden.

   Att erhålla denna follikelvätska utgör ingen ytterligare risk eller obehag för de som orsakas av reproduktionsbehandlingen, eftersom det kirurgiska ingreppet med oocytupptagning används för att erhålla follikelvätskan.

   • Metod för providentifiering Sperma- och follikelvätskeproverna kommer att identifieras på ett sätt som gör det möjligt att säkerställa deltagarnas identitet.
   • Provkonservering Både sädes- och follikulära vätskeprov kommer att förvaras i frysar i laboratoriet för Andrologi (IVI Murcia) vid -80°C tills vidare bearbetning, under överinseende av Dr Juan Carlos Martínez Soto. Proverna som skickas till universitetet i Murcia kommer att lagras av Dr. Carmen Matás Parra. Både anläggningarna vid University of Murcia och de av IVI-kliniken har begränsad tillgång, därför kommer proverna alltid att vara bevakade. Efter avslutad studie (januari 2019) kommer överskottsprover att förstöras enligt klinikens vanliga protokoll.

   F. Databas Data om provanalys (follikulär vätska och spermaprover) kommer att lagras i Excel-tabeller i IVI Murcias lokaler. Data om resultaten av de assisterade befruktningsbehandlingarna som har följts av patienterna som ingår i studien kommer att hämtas från IVI management system (SIVIS).

   G. Studera variabler

   Fyra klasser av variabler kommer att särskiljas efter deras relevans inom studien:

   Primär variabel: NO nivåer.

   Sekundära variabler: NOS-uttryck, hastighet av progressiva spermier, graviditetsfrekvens, biokemisk graviditet, graviditetsutveckling, implantationshastighet, utomkvedshavandeskapsfrekvens.

   Kontrollvariabler: Tyrosinfosforylering (optiska densitetsenheter), PKA (optiska densitetsenheter), proteinnitrosylering (optiska densitetsenheter), nitrater och nitriter (mikromolära enheter).

   Beskrivande variabler: moderns ålder, faderns ålder, manlig etiologi, kvinnlig etiologi, BMI, rökvana.

   H. Dataanalys

   Beskrivande analys:

   Statistisk sammanfattning av data som samlats in i studien. Kategoriska data kommer att presenteras i frekvenstabeller och histogram. De kontinuerliga värdena kommer att sammanfattas med medelvärde, standardavvikelse och konfidensintervall, de kommer att representeras av grafer över kvartiler eller densiteter.

   Den utforskande analysen av uppgifterna kommer att göra det möjligt att bedöma kvaliteten på uppgifterna och upptäckten av anomalier.

   Analys av homogenitet:

   Medelvärdena och proportionerna för de beskrivande variablerna (baslinje och demografi) kommer att jämföras för att validera studiegruppernas jämförbarhetsgrad. S chi-kvadrattest kommer att tillämpas i de kategoriska variablerna och, förutsatt att data följer en normalfördelning, ett T-test i de kontinuerliga variablerna. Om data inte följer en normalfördelning, skulle ett Mann-Whitney-test tillämpas.

   När det gäller att hitta beskrivande variabler fördelade på ett sätt att det finns statistiska skillnader mellan grupperna, kommer de att ingå i en regressionsmodell, för att kontrollera deras interferens i huvudrelationen som ska studeras.

   Jämförelse av NO-uttryck:

   För att validera en hypotes om korrelation av proportioner i NO-uttrycket kommer ett Fisher-test att tillämpas.

   För att utvärdera effekten av andra kovariabler som kan modifiera beteendet hos NO-uttryck, kommer en logistisk regressionsmodell att definieras.

   När det gäller jämförelsen av proteinnitrosylering kommer ett Students t-test att tillämpas förutsatt att data följer en normalfördelning. Om normalitetsantagandet inte kommer att uppfyllas, verifierat med ett Kolmogorov-Smirnof-test, skulle ett icke-parametriskt U-MannWhitney-test tillämpas.

   På samma sätt kommer en linjär regressionsmodell att definieras som möjliggör utvärdering av effekten av andra korrelerade variabler.

   Utvärdering av seminal kvalitet:

   För uppsättningen av variabler som utgör den seminala kvaliteten kommer ett t-Student-test att tillämpas förutsatt att data följer en normalfördelning. Om normalitetsantagandet inte kommer att uppfyllas, verifierat med ett Kolmogorov-Smirnof-test, skulle ett icke-parametriskt U-MannWhitney-test tillämpas.

   Utvärdering av graviditetsresultat:

   För den uppsättning variabler som definierar graviditetsresultaten kommer ett Fisher-test att tillämpas.

   Arbetsplan:

   Utvecklingsskeden och fördelning av hela forskargruppens uppgifter samt de uppdrag som planeras för den tekniska personalen. Ange dessutom plats / centrum för genomförandet av projektet.

   Utformningen av studien, såväl som utformningen av projektet, har utförts av läkarna Carmen Matás Parra och Juan Carlos Martínez Soto.

   Teamet av gynekologer som utgör enheten för reproduktiv medicin vid IVI Murcia-kliniken, Dr. Jose Landeras, María Nicolás, Laura Fernández och Martina Trabalón, kommer att ansvara för inkluderingen av patienter och spermadonatorer i studien, samt direkt ansvarig för den assisterade befruktningsbehandlingen som utförs på patienter. Sådan behandling inkluderar: val av behandling som ska utföras, äggstocksstimulering, oocytupptagningsprocedur för att samla in oocyter och follikulär vätska, samt embryoöverföring.

   Embryologerna Marta Molla, David Gumbao, Julián Marcos, Beatriz Amorocho och Ana Isabel Sanchez kommer att ansvara för processen för oocytbefruktning i befruktningslaboratoriet, samt urvalet av embryon som ska överföras.

   Florentin-Daniel Staicu, Carmen Matás Parra och Juan Carlos Martínez Soto kommer att utföra analysen av både sädes- och follikulära vätskeprover. Dessa analyser kommer att utföras både i lokalerna på IVI Murcia-kliniken och i laboratorierna vid University of Murcia.

   Dr. Jorge Chavarro kommer att genomföra de epidemiologiska och biostatistiska studierna.