Relation entre l'oxyde nitrique (NO) dans le liquide folliculaire et la capacité de fécondation des spermatozoïdes

Objectif principal:

Déterminer les changements dans l'expression de NOS et la nitrosylation des protéines chez les patients fertiles et infertiles, lors de l'ajout de L-Arginine, le substrat de la synthèse de NO, au milieu de capacitation des spermatozoïdes en présence/absence de liquide folliculaire humain (hFF).

Objectifs secondaires :

1. Rechercher si les effets de la hFF sur la capacitation des spermatozoïdes sont associés aux niveaux de NO dans le liquide.

2. Identifier la corrélation entre les niveaux de NO dans le hFF et les résultats cliniques des ART.

   MÉTHODOLOGIE

   A. Population La population incluse dans l'étude comprendra à la fois des donneurs de sperme et des couples fréquentant la clinique IVI Murcia pour un traitement de procréation assistée via des techniques de fécondation in vitro.

   B. Critères d'inclusion/exclusion En fonction des objectifs, tant la population que les critères d'inclusion et d'exclusion peuvent varier.

   Critères d'inclusion Objectif principal

   Examiner les modifications de l'expression de la NOS ainsi que la nitrosylation des protéines chez les patientes fertiles et hypofertiles. A cet effet, les groupes suivants seront recrutés :

   • un groupe d'hommes fertiles, tels que les donneurs de sperme fréquentant la clinique IVI Murcia ;
   • un groupe d'hommes hypofertiles composé de patients, qui fréquentent la clinique IVI Murcia pour subir un traitement de fécondation in vitro et qui possèdent un paramètre de spermiogramme altéré, selon les directives de l'OMS (2010).

   Afin d'atteindre les objectifs secondaires, les couples qui subissent un traitement de FIV ou d'ICSI seront inclus.

   Critères d'exclusion Seront exclus les couples qui subissent un diagnostic génétique préimplantatoire, ont été diagnostiqués avec un avortement à répétition (trois avortements consécutifs ou plus avant la semaine 20) ou un échec d'implantation (absence de grossesse après trois transferts d'embryons avec des embryons de bonne qualité chez les femmes de moins de 36 ans ou après deux transferts d'embryons chez les femmes de plus de 36 ans), ainsi que les femmes de plus de 40 ans.

   C. Taille de l'échantillon :

   Les valeurs de référence pour l'expression de la NOS n'étant pas disponibles et la variabilité de la distribution des spermatozoïdes progressifs étant élevée, il a été déterminé que pour détecter une différence de 20 % par rapport à la moyenne dans un test bilatéral, avec un niveau de signification de 5% et 80% de puissance statistique, 41 échantillons de sperme par groupe seront nécessaires. Une période de 24 mois est estimée pour atteindre le nombre d'échantillons séminaux.

   D. Conception expérimentale et interventions Étude de recherche biomédicale avec groupe témoin (donneurs de sperme fertile) et groupe expérimental (hommes hypofertiles)

   Interventions:

   Échantillons de sperme : seront obtenus par masturbation après 2 à 7 jours d'abstinence sexuelle. Tous les échantillons seront analysés conformément aux directives de l'OMS (2010). Pour éviter des visites inutiles aux hommes inclus dans l'étude, l'échantillon de sperme sera demandé lors d'une de leurs visites à la clinique.

   Les spermatozoïdes seront capacitifs en présence et en l'absence de hFF. Dans une première série d'expériences, le hFF sera supplémenté avec de la L-Arginine et l'inhibiteur de NOS L-NAME. Dans une autre série d'expériences, les mêmes suppléments au milieu de capacitation seront examinés, mais sans utiliser de hFF.

   Une série de techniques telles que le Western blot, la nitrosylation in situ et le Biotin Switch Assay seront utilisées pour déterminer tout changement dans l'expression de la NOS et la nitrosylation des protéines dans les spermatozoïdes. La technique de Western blot sera également appliquée pour évaluer d'autres marqueurs de capacitation tels que l'activité de la protéine kinase A (PKA), la phosphorylation de la tyrosine et la nitration de la tyrosine. Le même traitement sera effectué sur tous les échantillons de sperme, qu'ils proviennent de patients ou de donneurs de sperme. EN AUCUN CAS CES ÉCHANTILLONS DE SEMENCE NE SERONT UTILISÉS POUR RÉALISER UN TRAITEMENT DE REPRODUCTION ASSISTÉE.

   Échantillons de liquide folliculaire humain :

   Pour étudier la corrélation entre la concentration de NO dans le liquide folliculaire et le succès du traitement de procréation assistée, les échantillons de liquide folliculaire seront obtenus lors de la procédure de prélèvement des ovocytes. Après prélèvement des ovocytes, ces fluides sont normalement éliminés, mais dans ce cas les fluides seront centrifugés pendant 10 minutes à 2000g et conservés à -20°C jusqu'à l'évaluation.

   La concentration de NO sera déterminée à l'aide d'un système de mesure disponible dans le commerce. Le NO est rapidement oxydé en deux ions stables, à savoir le nitrite et le nitrate, qui peuvent être dosés à l'aide d'électrodes sélectives d'ions. Ces électrodes ont été miniaturisées pour pouvoir mesurer des échantillons jusqu'à 30-40 µl avec des limites de détection jusqu'à la plage inférieure de µM pour les deux espèces.

   Les essais de Western blot et de nitrosylation des protéines seront effectués au sein du laboratoire de physiologie animale de l'Université de Murcie (Faculté de médecine vétérinaire).

   Il convient de noter que le seul objectif de l'analyse du liquide folliculaire est de rechercher après le traitement de procréation assistée s'il existe une corrélation entre le résultat du traitement et les niveaux de NO. En aucun cas, les décisions de transfert d'embryons ne seront prises en fonction des niveaux de NO dans le liquide folliculaire.

   E. Prélèvement d'échantillons biologiques Des échantillons de sperme et de liquide folliculaire seront évalués dans la présente étude.

   • Objectif de la collecte des échantillons Les échantillons collectés dans la présente étude ne seront utilisés que pour la réalisation du projet de recherche. A chaque échantillon biologique un code sera attribué, qui sera indépendant du code NHC (numéro d'antécédents cliniques) des patients et ne sera connu que de l'équipe de recherche. Le Dr Juan Carlos Martínez Soto sera responsable du stockage et de la conservation des échantillons biologiques.
   • Méthode de prélèvement des échantillons Les échantillons biologiques ne seront obtenus qu'une fois que le patient aura signé le consentement éclairé correspondant. Les échantillons séminaux seront obtenus par masturbation après 2 à 7 jours d'abstinence sexuelle. Pour éviter les déplacements inutiles, le prélèvement des échantillons aura lieu lors de la visite du patient à la clinique.

   Les échantillons de liquide folliculaire seront obtenus le jour de la procédure de prélèvement d'ovocytes effectuée pour le traitement de fécondation in vitro que les patientes suivront. Ce fluide, qui est normalement jeté, ne sera utilisé que pour déterminer les valeurs de NO.

   L'obtention de ce liquide folliculaire ne pose aucun risque ou inconfort supplémentaire à ceux causés par le traitement de reproduction, puisque la procédure chirurgicale de prélèvement d'ovocytes est utilisée pour obtenir le liquide folliculaire.

   • Méthode d'identification des échantillons Les échantillons de sperme et de liquide folliculaire seront identifiés d'une manière qui permettra de sauvegarder l'identité des participants.
   • Conservation des échantillons Les échantillons de liquide séminal et folliculaire seront conservés dans des congélateurs du laboratoire d'andrologie (IVI Murcia) à -80°C jusqu'à leur traitement ultérieur, sous la supervision du Dr Juan Carlos Martínez Soto. Les échantillons envoyés à l'Université de Murcie seront conservés par le Dr Carmen Matás Parra. Les installations de l'Université de Murcie et celles de la clinique IVI ont un accès restreint, donc les échantillons seront toujours gardés. À la fin de l'étude (janvier 2019), les échantillons excédentaires seront détruits selon les protocoles habituels de la clinique.

   F. Base de données Les données concernant l'analyse des échantillons (échantillons de liquide folliculaire et de sperme) seront stockées dans des tableaux Excel dans les installations d'IVI Murcia. Les données concernant les résultats des traitements de procréation assistée qui ont été suivis par les patients inclus dans l'étude seront obtenues à partir du système de gestion IVI (SIVIS).

   G. Variables d'étude

   Quatre classes de variables seront distinguées selon leur pertinence au sein de l'étude :

   Variable primaire : AUCUN niveau.

   Variables secondaires : expression de la NOS, taux de spermatozoïdes progressifs, taux de grossesse, grossesse biochimique, évolution de la grossesse, taux d'implantation, taux de grossesse extra-utérine.

   Variables de contrôle : Phosphorylation de la tyrosine (unités de densité optique), PKA (unités de densité optique), nitrosylation des protéines (unités de densité optique), nitrates et nitrites (unités micromolaires).

   Variables descriptives : âge maternel, âge paternel, étiologie masculine, étiologie féminine, IMC, tabagisme.

   H. Analyse des données

   Analyse descriptive:

   Résumé statistique des données recueillies dans l'étude. Les données catégorielles seront présentées dans des tableaux de fréquence et des histogrammes. Les valeurs continues seront résumées avec la moyenne, l'écart type et l'intervalle de confiance, elles seront représentées par des graphiques de quartiles ou de densités.

   L'analyse exploratoire des données permettra d'évaluer la qualité des données et la détection des anomalies.

   Analyse d'homogénéité :

   Les moyennes et les proportions des variables descriptives (de base et démographiques) seront comparées pour valider le degré de comparabilité des groupes d'étude. Le test S chi carré sera appliqué dans les variables catégorielles et, en supposant que les données suivent une distribution normale, un test T dans les variables continues. Si les données ne suivent pas une distribution normale, un test de Mann-Whitney sera appliqué.

   Dans le cas de trouver des variables descriptives distribuées de manière à ce qu'il y ait des différences statistiques entre les groupes, elles seront incluses dans un modèle de régression, pour contrôler leur interférence dans la relation principale à étudier.

   Comparaison de l'expression NO :

   Pour valider une hypothèse de corrélation des proportions dans l'expression du NO, un test de Fisher sera appliqué.

   Pour évaluer l'effet d'autres covariables pouvant modifier le comportement de l'expression NO, un modèle de régression logistique sera défini.

   Comme pour la comparaison de la nitrosylation des protéines, un test t de Student sera appliqué en supposant que les données suivent une distribution normale. Si l'hypothèse de normalité n'est pas satisfaite, vérifiée par un test de Kolmogorov-Smirnof, un test U-MannWhitney non paramétrique serait appliqué.

   De la même manière, un modèle de régression linéaire sera défini qui permet l'évaluation de l'effet d'autres variables corrélées.

   Évaluation de la qualité séminale :

   Pour l'ensemble des variables qui composent la qualité séminale, un test t-Student sera appliqué en supposant que les données suivent une distribution normale. Si l'hypothèse de normalité n'est pas satisfaite, vérifiée par un test de Kolmogorov-Smirnof, un test U-MannWhitney non paramétrique serait appliqué.

   Évaluation des résultats gestationnels :

   Pour l'ensemble des variables qui définissent les résultats de la gestation, un test de Fisher sera appliqué.

   Plan de travail:

   Étapes d'élaboration et répartition des tâches de l'ensemble de l'équipe de recherche et des missions prévues pour le personnel technique. Indiquez en plus le lieu/centre de réalisation du projet.

   La conception de l'étude, ainsi que la rédaction du projet ont été réalisées par les docteurs Carmen Matás Parra et Juan Carlos Martínez Soto.

   L'équipe de gynécologues qui composent l'unité de médecine de la reproduction de la clinique IVI Murcia, le Dr Jose Landeras, María Nicolás, Laura Fernández et Martina Trabalón, sera responsable de l'inclusion des patients et des donneurs de sperme dans l'étude, ainsi que le responsable direct du traitement de procréation assistée effectué sur les patients. Ce traitement comprend : le choix du traitement à effectuer, la stimulation ovarienne, la procédure de prélèvement d'ovocytes pour collecter les ovocytes et le liquide folliculaire, ainsi que le transfert d'embryons.

   Les embryologistes Marta Molla, David Gumbao, Julián Marcos, Beatriz Amorocho et Ana Isabel Sanchez seront responsables du processus de fécondation des ovocytes dans le laboratoire de fécondation, ainsi que de la sélection des embryons à transférer.

   Florentin-Daniel Staicu, Carmen Matás Parra et Juan Carlos Martínez Soto effectueront l'analyse d'échantillons de liquide séminal et folliculaire. Ces analyses seront effectuées à la fois dans les installations de la clinique IVI Murcie et dans les laboratoires de l'Université de Murcie.

   Le Dr Jorge Chavarro conduira les études épidémiologiques et biostatistiques.