Forholdet mellom nitrogenoksid (NO) i follikkelvæske og sædbefruktningsevne

Hovedoppgave:

Bestem endringer i NOS-ekspresjonen og proteinnitrosylering hos fertile og infertile pasienter, når L-Arginin, substratet for NO-syntese, tilsettes til spermkapasitasjonsmediet i nærvær/fravær av human follikkelvæske (hFF).

Sekundære mål:

1. Undersøk om effekten av hFF på sædkapasiteten er assosiert med NO-nivåer i væsken.

2. Identifiser sammenhengen mellom NO-nivåer i hFF og de kliniske resultatene fra ART.

   METODOLOGI

   A. Populasjon Populasjonen som er inkludert i studien vil omfatte både sæddonorer og par som går på klinikken IVI Murcia for behandling av assistert befruktning via teknikker for in vitro fertilisering.

   B. Inkluderings-/eksklusjonskriterier Avhengig av målene kan både populasjonen og inkluderings- og eksklusjonskriteriene variere.

   Inkluderingskriterier Hovedmål

   Å undersøke modifikasjonene i NOS-uttrykket samt proteinnitrosyleringen hos fertile og subfertile pasienter. Til dette formålet vil følgende grupper rekrutteres:

   • en gruppe fertile menn, slik som sæddonorer som går på klinikken IVI Murcia;
   • en gruppe subfertile menn som består av pasienter som går til klinikken IVI Murcia for å gjennomgå en in vitro fertiliseringsbehandling og som har én endret spermiogramparameter, i henhold til WHOs (2010) retningslinjer.

   For å nå de sekundære målene vil par som gjennomgår en IVF- eller ICSI-behandling bli inkludert.

   Eksklusjonskriterier Vil bli ekskludert par som gjennomgår preimplantasjonsgenetisk diagnose, ble diagnostisert med repeterende abort (tre eller flere påfølgende aborter før uke 20) eller implantasjonssvikt (manglende graviditet etter tre embryooverføringer med embryoer av god kvalitet hos kvinner under 36 år eller etter to embryooverføringer hos kvinner over 36 år), samt kvinner over 40 år.

   C. Prøvestørrelse:

   Siden referanseverdier for NOS-uttrykk ikke er tilgjengelige og siden variabiliteten i fordelingen av progressive sædceller er høy, har det blitt bestemt at for å oppdage en forskjell på 20 % i forhold til gjennomsnittet i en bilateral test, med et signifikansnivå på 5 % og 80 % av statistisk kraft, 41 sædprøver per gruppe vil være nødvendig. En periode på 24 måneder er beregnet for å nå antallet sædprøver.

   D. Eksperimentell design og intervensjoner Biomedisinsk forskningsstudie med kontrollgruppe (fertile sæddonorer) og eksperimentell gruppe (subfertile menn)

   Intervensjoner:

   Sædprøver: vil bli tatt ved onani etter 2-7 dager med seksuell avholdenhet. Alle prøver vil bli analysert i henhold til WHOs retningslinjer (2010). For å unngå unødvendige besøk for mennene som er inkludert i studien, vil sædprøven bli forespurt under ett av deres besøk på klinikken.

   Spermatozoer vil bli kapasitert i nærvær og fravær av hFF. I et første sett med eksperimenter vil hFF bli supplert med L-arginin og NOS-hemmeren L-NAME. I et annet sett med eksperimenter vil de samme tilskuddene til kapasitasjonsmediet bli undersøkt, men uten bruk av hFF.

   En rekke teknikker som Western blot, in situ nitrosylering og Biotin Switch Assay vil bli brukt for å bestemme eventuelle endringer i NOS-uttrykket og proteinnitrosylering i sædceller. Western blot-teknikken vil også bli brukt for å evaluere andre kapasitasjonsmarkører som proteinkinase A (PKA) aktivitet, tyrosinfosforylering og tyrosinitrering. Samme behandling vil bli utført på alle sædprøver uavhengig av om de kommer fra pasienter eller fra sædgivere. I INGEN TILFELLE VIL DISSE SÆDPRØVENE BLI BRUKT TIL Å UTFØRE EN ASSISTERT REPRODUKSJONSBEHANDLING.

   Human follikulær væskeprøver:

   For å studere sammenhengen mellom NO-konsentrasjonen i follikulærvæske og suksessen med assistert reproduksjonsbehandling, vil follikulærvæskeprøvene innhentes under prosedyren for oppsamling av oocytter. Etter oocyttfjerning blir disse væskene normalt eliminert, men i dette tilfellet vil væskene sentrifugeres i 10 minutter ved 2000g og lagres ved -20°C frem til evaluering.

   NO-konsentrasjonen vil bli bestemt ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig målesystem. NO oksideres raskt til to stabile ioner, nemlig nitritt og nitrat, som kan analyseres ved å bruke ioneselektive elektroder. Disse elektrodene har blitt miniatyrisert for å kunne måle prøver ned til 30-40 µl med deteksjonsgrenser ned til det lave µM-området for begge arter.

   Western blot- og proteinnitrosyleringsanalysene vil bli utført inne i Animal Physiology-laboratoriet, ved University of Murcia (Veterinærmedisinsk fakultet).

   Det skal bemerkes at det eneste formålet med å analysere follikkelvæsken er å undersøke etter assistert befruktning om det er noen sammenheng mellom resultatet av behandlingen og NO-nivåene. Under ingen omstendigheter vil embryooverføringsbeslutninger bli tatt basert på NO-nivåene i follikkelvæsken.

   E. Innsamling av biologiske prøver Sperm- og follikkelvæskeprøver vil bli evaluert i denne studien.

   • Formål med prøveinnsamling Prøvene som samles inn i denne studien vil kun bli brukt til gjennomføring av forskningsprosjektet. Til hver biologisk prøve vil det bli tildelt en kode, som vil være uavhengig av NHC-koden (antall klinisk historie) til pasientene og vil kun være kjent av forskerteamet. Dr. Juan Carlos Martínez Soto vil være ansvarlig for oppbevaring og oppbevaring av de biologiske prøvene.
   • Metode for prøvetaking De biologiske prøvene innhentes først når pasienten har signert det tilhørende informerte samtykket. Sædprøvene vil bli tatt ved onani etter 2-7 dager med seksuell avholdenhet. For å unngå unødvendige forskyvninger vil prøvetakingen foregå under pasientbesøket til klinikken.

   Follikulærvæskeprøvene vil bli tatt på dagen for prosedyren for oocytthenting utført for in vitro fertiliseringsbehandlingen som pasientene skal følge. Denne væsken, som normalt kasseres, vil kun brukes til å bestemme NO-verdier.

   Innhenting av denne follikkelvæsken utgjør ingen ytterligere risiko eller ubehag for de som er forårsaket av reproduksjonsbehandlingen, siden den kirurgiske prosedyren for oppsamling av oocytter brukes til å oppnå follikkelvæsken.

   • Metode for prøveidentifikasjon Prøvene av sæd og follikkelvæske vil bli identifisert på en måte som gjør det mulig å sikre deltakernes identitet.
   • Prøvekonservering Både sæd- og follikkelvæskeprøver vil bli lagret i frysere i Andrologilaboratoriet (IVI Murcia) ved -80°C inntil videre behandling, under tilsyn av Dr Juan Carlos Martínez Soto. Prøvene som sendes til Universitetet i Murcia vil bli lagret av Dr. Carmen Matás Parra. Både fasilitetene til University of Murcia og de til IVI-klinikken har begrenset tilgang, derfor vil prøvene alltid være bevoktet. Etter fullføring av studien (januar 2019), vil overskuddsprøvene bli destruert etter klinikkens vanlige protokoller.

   F. Database Dataene vedrørende prøveanalyse (follikulærvæske og sædprøver), vil bli lagret i Excel-tabeller i fasilitetene til IVI Murcia. Dataene angående resultatene av assisterte befruktningsbehandlinger som er fulgt av pasientene som er inkludert i studien, vil bli hentet fra IVI management system (SIVIS).

   G. Studievariabler

   Fire klasser av variabler vil bli skilt ut i henhold til deres relevans i studien:

   Primærvariabel: INGEN nivåer.

   Sekundære variabler: NOS-uttrykk, rate av progressiv sperm, graviditetsrate, biokjemisk graviditet, graviditetsutvikling, implantasjonshastighet, ektopisk graviditet.

   Kontrollvariabler: Tyrosinfosforylering (optiske tetthetsenheter), PKA (optiske tetthetsenheter), proteinnitrosylering (optiske tetthetsenheter), nitrater og nitritter (mikromolare enheter).

   Beskrivende variabler: mors alder, fars alder, mannlig etiologi, kvinnelig etiologi, BMI, røykevaner.

   H. Dataanalyse

   Beskrivende analyse:

   Statistisk oppsummering av dataene samlet inn i studien. Kategoriske data vil bli presentert i frekvenstabeller og histogrammer. De kontinuerlige verdiene vil bli oppsummert med gjennomsnitt, standardavvik og konfidensintervall, de vil bli representert ved grafer av kvartiler eller tettheter.

   Den utforskende analysen av dataene vil tillate å vurdere kvaliteten på dataene og påvisningen av anomalier.

   Analyse av homogenitet:

   Middelene og proporsjonene til de beskrivende variablene (grunnlinje og demografi) vil bli sammenlignet for å validere graden av sammenlignbarhet av studiegruppene. S chi-kvadrattest vil bli brukt i de kategoriske variablene og, forutsatt at dataene følger en normalfordeling, en T-test i de kontinuerlige variablene. Hvis dataene ikke følger en normalfordeling, vil en Mann-Whitney-test bli brukt.

   Ved å finne deskriptive variabler fordelt på en måte at det er statistiske forskjeller mellom gruppene, vil de inkluderes i en regresjonsmodell, for å kontrollere deres interferens i hovedrelasjonen som skal studeres.

   Sammenligning av NO-uttrykk:

   For å validere en hypotese om korrelasjon av proporsjoner i NO-uttrykket, vil en Fisher-test bli brukt.

   For å evaluere effekten av andre kovariabler som kan endre oppførselen til NO-uttrykk, vil en logistisk regresjonsmodell bli definert.

   Når det gjelder sammenligning av proteinnitrosylering, vil en Students t-test bli brukt forutsatt at dataene følger en normalfordeling. Hvis normalitetsantagelsen ikke vil bli oppfylt, verifisert av en Kolmogorov-Smirnof-test, vil en ikke-parametrisk U-MannWhitney-test bli brukt.

   På samme måte vil det bli definert en lineær regresjonsmodell som gjør det mulig å evaluere effekten av andre korrelerte variabler.

   Evaluering av seminal kvalitet:

   For settet med variabler som utgjør den seminale kvaliteten, vil en t-Student-test bli brukt forutsatt at dataene følger en normalfordeling. Hvis normalitetsantagelsen ikke vil bli oppfylt, verifisert av en Kolmogorov-Smirnof-test, vil en ikke-parametrisk U-MannWhitney-test bli brukt.

   Evaluering av svangerskapsutfall:

   For settet med variabler som definerer svangerskapsresultatene, vil en Fisher-test bli brukt.

   Arbeidsplan:

   Utviklingsstadier og fordeling av oppgavene til hele forskerteamet, og oppdragene som er planlagt for det tekniske personalet. Angi i tillegg sted/senter for realisering av prosjektet.

   Utformingen av studien, samt utkastet til prosjektet er utført av legene Carmen Matás Parra og Juan Carlos Martínez Soto.

   Teamet av gynekologer som utgjør enheten for reproduktiv medisin ved IVI Murcia-klinikken, Dr. Jose Landeras, María Nicolás, Laura Fernández og Martina Trabalón, vil være ansvarlig for inkludering av pasienter og sæddonorer i studien, samt den direkte ansvarlige for assistert befruktningsbehandling utført på pasienter. Slik behandling inkluderer: valg av behandling som skal utføres, eggstokkstimulering, prosedyre for oppsamling av oocytter for å samle oocytter og follikkelvæske, samt embryooverføring.

   Embryologene Marta Molla, David Gumbao, Julián Marcos, Beatriz Amorocho og Ana Isabel Sanchez vil være ansvarlige for prosessen med oocyttbefruktning i befruktningslaboratoriet, samt utvalget av embryoer som skal overføres.

   Florentin-Daniel Staicu, Carmen Matás Parra og Juan Carlos Martínez Soto vil utføre analysen av både sæd- og follikkelvæskeprøver. Disse analysene vil bli utført både i fasilitetene til IVI Murcia-klinikken og i laboratoriene til University of Murcia.

   Dr. Jorge Chavarro vil gjennomføre de epidemiologiske og biostatistiske studiene.