Vztah mezi oxidem dusnatým (NO) ve folikulární tekutině a schopností oplodnění spermií

Hlavní cíl:

Určete změny v expresi NOS a nitrosylaci proteinu u fertilních a neplodných pacientek, když se přidá L-arginin, substrát pro syntézu NO, do média pro kapacitu spermií v přítomnosti/nepřítomnosti lidské folikulární tekutiny (hFF).

Sekundární cíle:

1. Zkoumejte, zda jsou účinky hFF na kapacitu spermií spojeny s hladinami NO v tekutině.

2. Identifikujte korelaci mezi hladinami NO v hFF a klinickými výsledky z ART.

   METODOLOGIE

   A. Populace Populace zahrnutá do studie bude zahrnovat jak dárce spermatu, tak páry navštěvující kliniku IVI Murcia pro léčbu asistované reprodukce pomocí technik in vitro fertilizace.

   B. Kritéria inkluze/exkluze V závislosti na cílech se mohou lišit jak populace, tak kritéria inkluze a exkluze.

   Kritéria pro zařazení Hlavní cíl

   Zkoumat modifikace v expresi NOS a také nitrosylaci proteinu u fertilních a subfertilních pacientek. Za tímto účelem budou přijaty tyto skupiny:

   • skupina fertilních mužů, jako jsou dárci spermatu navštěvující kliniku IVI Murcia;
   • skupina subfertilních mužů složená z pacientů, kteří navštěvují kliniku IVI Murcia za účelem podstoupení in vitro fertilizace a kteří mají jeden změněný parametr spermiogramu podle doporučení WHO (2010).

   Aby bylo dosaženo sekundárních cílů, budou zahrnuty páry, které podstoupí léčbu IVF nebo ICSI.

   Kritéria vyloučení Budou vyloučeny páry, které podstoupí preimplantační genetickou diagnostiku, u kterých byl diagnostikován opakovaný potrat (tři a více po sobě jdoucích potratů před 20. týdnem) nebo selhání implantace (chybějící těhotenství po třech transferech embryí s kvalitními embryi u žen do 36 let nebo po dvou embryotransferech u žen starších 36 let), stejně jako u žen nad 40 let.

   C. Velikost vzorku:

   Protože referenční hodnoty pro expresi NOS nejsou k dispozici a protože variabilita distribuce progresivních spermií je vysoká, bylo stanoveno, že pro detekci rozdílu 20 % vzhledem k průměru v bilaterálním testu s hladinou významnosti 5 % a 80 % statistické síly, bude zapotřebí 41 vzorků spermatu na skupinu. Odhaduje se, že období 24 měsíců dosáhne počtu semenných vzorků.

   D. Experimentální design a intervence Biomedicínská výzkumná studie s kontrolní skupinou (dárci plodného spermatu) a experimentální skupinou (subfertilní muži)

   Zásahy:

   Vzorky spermatu: budou získány masturbací po 2-7 dnech sexuální abstinence. Všechny vzorky budou analyzovány podle pokynů WHO (2010). Aby se zabránilo zbytečným návštěvám mužů zařazených do studie, bude vzorek spermatu požádán během jedné z jejich návštěv na klinice.

   Spermie budou kapacitovány v přítomnosti a nepřítomnosti hFF. V první sadě experimentů bude hFF doplněn L-argininem a NOS inhibitorem L-NAME. V další sadě experimentů budou zkoumány stejné doplňky ke kapacitnímu médiu, ale bez použití hFF.

   Ke stanovení jakýchkoli změn v expresi NOS a nitrosylaci proteinů ve spermiích bude použita řada technik, jako je Western blot, in situ nitrosylace a Biotin Switch Assay. Technika Western blot bude také použita pro hodnocení dalších kapacitních markerů, jako je aktivita proteinkinázy A (PKA), fosforylace tyrosinu a nitrace tyrosinu. Stejné ošetření bude provedeno u všech vzorků spermatu bez ohledu na to, zda pocházejí od pacientů nebo od dárců spermatu. V ŽÁDNÉM PŘÍPADĚ NEBUDOU TYTO VZORKY SEMERA POUŽITY K PROVEDENÍ OŠETŘENÍ ASISTOVANÉ REPRODUKCE.

   Vzorky lidské folikulární tekutiny:

   Pro studium korelace mezi koncentrací NO ve folikulární tekutině a úspěšností léčby asistovanou reprodukcí budou vzorky folikulární tekutiny získány během procedury odběru oocytů. Po odstranění oocytů jsou tyto tekutiny normálně eliminovány, ale v tomto případě budou tekutiny centrifugovány po dobu 10 minut při 2000 g a skladovány při -20 °C až do vyhodnocení.

   Koncentrace NO bude stanovena pomocí komerčně dostupného měřicího systému. NO se rychle oxiduje na dva stabilní ionty, jmenovitě dusitany a dusičnany, které lze stanovit pomocí iontově selektivních elektrod. Tyto elektrody byly miniaturizovány, aby byly schopny měřit vzorky až do 30-40 µl s detekčními limity až do nízkého rozsahu µM pro oba druhy.

   Western blot a testy nitrosylace proteinů budou prováděny v laboratoři živočišné fyziologie na Univerzitě v Murcii (Fakulta veterinárního lékařství).

   Je třeba poznamenat, že jediným cílem analýzy folikulární tekutiny je zjistit po léčbě asistovanou reprodukcí, zda existuje nějaká korelace mezi výsledkem léčby a hladinami NO. Za žádných okolností nebudou rozhodnutí o přenosu embrya činěna na základě hladin NO ve folikulární tekutině.

   E. Odběr biologických vzorků V této studii budou hodnoceny vzorky spermií a folikulární tekutiny.

   • Účel sběru vzorků Vzorky shromážděné v této studii budou použity pouze pro dokončení výzkumného projektu. Každému biologickému vzorku bude přidělen kód, který bude nezávislý na kódu NHC (počet klinické anamnézy) pacientů a bude znám pouze výzkumnému týmu. Dr. Juan Carlos Martínez Soto bude zodpovědný za skladování a úschovu biologických vzorků.
   • Metoda odběru vzorků Biologické vzorky budou odebrány až poté, co pacient podepíše odpovídající informovaný souhlas. Semenné vzorky budou získány masturbací po 2-7 dnech sexuální abstinence. Aby se předešlo zbytečným přesunům, bude odběr vzorků probíhat během návštěvy pacienta na klinice.

   Vzorky folikulární tekutiny budou odebrány v den odběru oocytů provedeného pro léčbu in vitro fertilizací, kterou budou pacientky následovat. Tato tekutina, která se běžně vyhazuje, bude použita pouze ke stanovení hodnot NO.

   Získání této folikulární tekutiny nepředstavuje žádné další riziko nebo nepohodlí k těm, které jsou způsobeny reprodukční léčbou, protože k získání folikulární tekutiny se používá chirurgický postup odběru oocytů.

   • Metoda identifikace vzorku Vzorky spermatu a folikulární tekutiny budou identifikovány způsobem, který umožní chránit identitu účastníků.
   • Konzervace vzorků Vzorky semenné i folikulární tekutiny budou až do dalšího zpracování skladovány v mrazicích boxech v laboratoři Andrology (IVI Murcia) při -80°C pod dohledem Dr. Juana Carlose Martíneze Sota. Vzorky zaslané na univerzitu v Murcii bude uložena Dr. Carmen Matás Parra. Jak do zařízení univerzity v Murcii, tak do zařízení kliniky IVI mají omezený přístup, proto budou vzorky vždy střeženy. Po dokončení studie (leden 2019) budou přebytečné vzorky zlikvidovány podle obvyklých protokolů kliniky.

   F. Databáze Údaje týkající se analýzy vzorků (vzorky folikulární tekutiny a spermatu) budou uloženy v tabulkách Excel v zařízeních IVI Murcia. Údaje o výsledcích léčby asistované reprodukce, které pacientky zařazené do studie absolvovaly, budou získány ze systému řízení IVI (SIVIS).

   G. Studijní proměnné

   Podle jejich relevance v rámci studie budou rozlišeny čtyři třídy proměnných:

   Primární proměnná: hladiny NO.

   Sekundární proměnné: exprese NOS, míra progresivních spermií, míra těhotenství, biochemické těhotenství, vývoj těhotenství, míra implantace, míra mimoděložního těhotenství.

   Kontrolní proměnné: Fosforylace tyrosinu (jednotky optické hustoty), PKA (jednotky optické hustoty), nitrosylace proteinů (jednotky optické hustoty), dusičnany a dusitany (mikromolární jednotky).

   Popisné proměnné: věk matky, věk otce, mužská etiologie, ženská etiologie, BMI, kouření.

   H. Analýza dat

   Popisná analýza:

   Statistické shrnutí dat shromážděných ve studii. Kategorická data budou prezentována ve frekvenčních tabulkách a histogramech. Spojité hodnoty budou shrnuty s průměrem, směrodatnou odchylkou a intervalem spolehlivosti, budou reprezentovány grafy kvartilů nebo hustot.

   Průzkumná analýza dat umožní posoudit kvalitu dat a odhalit anomálie.

   Analýza homogenity:

   Pro ověření stupně srovnatelnosti studijních skupin budou porovnány průměry a podíly popisných proměnných (výchozí a demografické). S chí-kvadrát test bude aplikován v kategoriálních proměnných a za předpokladu, že data sledují normální rozdělení, T-test v spojitých proměnných. Pokud data nesledují normální rozdělení, použije se Mann-Whitney test.

   V případě nalezení deskriptivních proměnných distribuovaných tak, že mezi skupinami existují statistické rozdíly, budou zahrnuty do regresního modelu, aby se řídila jejich interference v hlavním studovaném vztahu.

   Srovnání výrazu NO:

   Pro ověření hypotézy korelace proporcí v expresi NO bude použit Fisherův test.

   Pro vyhodnocení vlivu dalších kovariát, které mohou modifikovat chování exprese NO, bude definován model logistické regrese.

   Pokud jde o srovnání nitrosylace proteinů, použije se Studentův t-test za předpokladu, že data sledují normální rozdělení. Pokud nebude splněn předpoklad normality, ověřený Kolmogorov-Smirnofovým testem, použije se neparametrický U-MannWhitney test.

   Stejně tak bude definován lineární regresní model, který umožňuje vyhodnocení vlivu dalších korelovaných proměnných.

   Hodnocení kvality semene:

   Pro množinu proměnných, které tvoří kvalitu semene, bude aplikován t-Student test za předpokladu, že data sledují normální rozdělení. Pokud nebude splněn předpoklad normality, ověřený Kolmogorov-Smirnofovým testem, použije se neparametrický U-MannWhitney test.

   Hodnocení výsledků těhotenství:

   Pro sadu proměnných, které definují výsledky březosti, bude aplikován Fisherův test.

   Pracovní plán:

   Vývojové etapy a rozdělení úkolů celého řešitelského týmu a plánovaných úkolů pro technický personál. Dále uveďte místo / centrum realizace projektu.

   Návrh studie, stejně jako návrh projektu, provedli lékaři Carmen Matás Parra a Juan Carlos Martínez Soto.

   Tým gynekologů, kteří tvoří Oddělení reprodukční medicíny na klinice IVI Murcia, Dr. Jose Landeras, María Nicolás, Laura Fernández a Martina Trabalón, bude zodpovědný za zařazení pacientek a dárců spermatu do studie, stejně jako přímo odpovědný za léčbu asistované reprodukce prováděnou na pacientech. Taková léčba zahrnuje: volbu léčby, která má být provedena, stimulaci vaječníků, postup odběru oocytů a folikulární tekutiny, stejně jako přenos embrya.

   Embryologové Marta Molla, David Gumbao, Julián Marcos, Beatriz Amorocho a Ana Isabel Sanchez budou zodpovědní za proces oplodnění oocytů v oplodňovací laboratoři a také za výběr embryí k přenosu.

   Florentin-Daniel Staicu, Carmen Matás Parra a Juan Carlos Martínez Soto provedou analýzu vzorků semenné i folikulární tekutiny. Tyto analýzy budou prováděny jak v zařízeních kliniky IVI Murcia, tak v laboratořích University of Murcia.

   Dr. Jorge Chavarro bude provádět epidemiologické a biostatistické studie.