Relação entre o óxido nítrico (NO) no fluido folicular e a capacidade de fertilização do esperma

Objetivo principal:

Determinar alterações na expressão de NOS e nitrosilação de proteínas em pacientes férteis e inférteis, ao adicionar L-Arginina, substrato para a síntese de NO, ao meio de capacitação espermática na presença/ausência de fluido folicular humano (hFF).

Objetivos Secundários:

1. Investigar se os efeitos do hFF na capacitação espermática estão associados aos níveis de NO no fluido.

2. Identificar a correlação entre os níveis de NO em hFF e os resultados clínicos das ARTs.

   METODOLOGIA

   A. População A população incluída no estudo compreenderá doadores de sêmen e casais atendidos na clínica IVI Murcia para um tratamento de reprodução assistida por meio de técnicas de fertilização in vitro.

   B. Critérios de inclusão/exclusão Dependendo dos objetivos, tanto a população quanto os critérios de inclusão e exclusão podem variar.

   Critérios de inclusão Objetivo principal

   Examinar as modificações na expressão de NOS, bem como a nitrosilação de proteínas em pacientes férteis e subférteis. Para o efeito, serão recrutados os seguintes grupos:

   • um grupo de homens férteis, como os doadores de sêmen atendidos na clínica IVI Murcia;
   • um grupo de homens subférteis composto por pacientes, que frequentam a clínica IVI Murcia para se submeter a um tratamento de fertilização in vitro e que possuem um parâmetro de espermograma alterado, de acordo com as diretrizes da OMS (2010).

   Para atingir os Objetivos Secundários, serão incluídos casais que se submetem a um tratamento de fertilização in vitro ou ICSI.

   Critérios de exclusão Serão excluídos casais que se submeterem a diagnóstico genético pré-implantacional, diagnosticados com aborto de repetição (três ou mais abortos consecutivos antes da 20ª semana) ou falha de implantação (falta de gravidez após três transferências embrionárias com embriões de boa qualidade em mulheres com menos de 36 anos ou após duas transferências de embriões em mulheres com mais de 36 anos de idade), bem como mulheres com mais de 40 anos de idade.

   C. Tamanho da amostra:

   Como os valores de referência para a expressão de NOS não estão disponíveis e como a variabilidade da distribuição dos espermatozoides progressivos é alta, foi determinado que para detectar uma diferença de 20% em relação à média em um teste bilateral, com um nível de significância de 5% e 80% do poder estatístico, serão necessárias 41 amostras de sêmen por grupo. Estima-se um período de 24 meses para atingir o número de amostras seminais.

   D. Desenho experimental e intervenções Estudo de pesquisa biomédica com grupo controle (doadores de sêmen férteis) e grupo experimental (homens subférteis)

   Intervenções:

   Amostras de sêmen: serão obtidas por masturbação após 2-7 dias de abstinência sexual. Todas as amostras serão analisadas de acordo com as diretrizes da OMS (2010). Para evitar visitas desnecessárias aos homens incluídos no estudo, a amostra de sêmen será solicitada durante uma de suas visitas ao ambulatório.

   Os espermatozóides serão capacitados na presença e ausência de hFF. Em um primeiro conjunto de experimentos, o hFF será suplementado com L-Arginina e o inibidor de NOS L-NAME. Em outro conjunto de experimentos serão examinadas as mesmas suplementações ao meio de capacitação, mas sem o uso de hFF.

   Uma série de técnicas como Western blot, nitrosilação in situ e Biotin Switch Assay serão utilizadas para determinar quaisquer alterações na expressão de NOS e nitrosilação de proteínas em espermatozóides. A técnica de Western blot também será aplicada para avaliar outros marcadores de capacitação como a atividade da Proteína Quinase A (PKA), fosforilação da tirosina e nitração da tirosina. O mesmo tratamento será realizado em todas as amostras de sêmen, independentemente de serem provenientes de pacientes ou de doadores de sêmen. EM NENHUM CASO ESSAS AMOSTRAS DE SÊMEN SERÃO USADAS PARA REALIZAR UM TRATAMENTO DE REPRODUÇÃO ASSISTIDA.

   Amostras de fluido folicular humano:

   Para estudar a correlação entre a concentração de NO no fluido folicular e o sucesso do tratamento de reprodução assistida, as amostras de fluido folicular serão obtidas durante o procedimento de coleta de ovócitos. Após a retirada dos oócitos, esses fluidos são normalmente eliminados, mas neste caso os fluidos serão centrifugados por 10 minutos a 2000g e armazenados a -20°C até a avaliação.

   A concentração de NO será determinada com a ajuda de um sistema de medição disponível comercialmente. O NO é rapidamente oxidado em dois íons estáveis, nitrito e nitrato, que podem ser testados usando eletrodos seletivos de íons. Esses eletrodos foram miniaturizados para serem capazes de medir amostras de até 30-40 µl com limites de detecção até a faixa de baixo µM para ambas as espécies.

   Os ensaios de Western blot e de nitrosilação de proteínas serão realizados no laboratório de Fisiologia Animal da Universidade de Múrcia (Faculdade de Medicina Veterinária).

   Cabe ressaltar que o único objetivo da análise do fluido folicular é investigar após o tratamento de reprodução assistida se existe alguma correlação entre o resultado do tratamento e os níveis de NO. Sob nenhuma circunstância as decisões de transferência de embriões serão tomadas com base nos níveis de NO no fluido folicular.

   E. Coleta de amostras biológicas Amostras de esperma e fluido folicular serão avaliadas no presente estudo.

   • Finalidade da coleta da amostra As amostras coletadas no presente estudo serão utilizadas apenas para a finalização do projeto de pesquisa. A cada amostra biológica será atribuído um código, que será independente do código NHC (número da história clínica) dos doentes e apenas será conhecido pela equipa de investigação. O Dr. Juan Carlos Martínez Soto será o responsável pelo armazenamento e guarda das amostras biológicas.
   • Método de colheita de amostras As amostras biológicas só serão obtidas depois de o paciente ter assinado o respectivo consentimento informado. As amostras seminais serão obtidas por masturbação após 2-7 dias de abstinência sexual. Para evitar deslocamentos desnecessários, a coleta da amostra ocorrerá durante a visita do paciente ao ambulatório.

   As amostras de fluido folicular serão obtidas no dia do procedimento de coleta de ovócitos realizado para o tratamento de fertilização in vitro que as pacientes seguirão. Este fluido, que normalmente é descartado, será utilizado apenas para determinar os valores de NO.

   A obtenção desse fluido folicular não representa nenhum risco ou desconforto adicional aos causados ​​pelo tratamento de reprodução, pois para a obtenção do fluido folicular é utilizado o procedimento cirúrgico de captação de ovócitos.

   • Método de identificação das amostras As amostras de sêmen e fluido folicular serão identificadas de forma a permitir resguardar a identidade dos participantes.
   • Conservação das amostras As amostras tanto do fluido seminal quanto do fluido folicular serão armazenadas em freezers no laboratório de Andrologia (IVI Murcia) a -80°C até o processamento posterior, sob a supervisão do Dr. Juan Carlos Martínez Soto. As amostras enviadas à Universidade de Múrcia serão armazenadas pela Dra. Carmen Matás Parra. Tanto as instalações da Universidade de Múrcia como as da clínica IVI têm acesso restrito, pelo que as amostras estarão sempre guardadas. Após a conclusão do estudo (janeiro de 2019), as amostras excedentes serão destruídas seguindo os protocolos usuais da clínica.

   F. Base de dados Os dados relativos à análise das amostras (fluido folicular e amostras de sêmen) serão armazenados em tabelas Excel nas instalações do IVI Murcia. Os dados relativos aos resultados dos tratamentos de reprodução assistida seguidos pelas pacientes incluídas no estudo serão obtidos do sistema de gerenciamento IVI (SIVIS).

   G. Variáveis ​​de estudo

   Quatro classes de variáveis ​​serão distinguidas de acordo com sua relevância dentro do estudo:

   Variável Primária: Níveis de NO.

   Variáveis ​​secundárias: expressão de NOS, taxa de esperma progressivo, taxa de gravidez, gravidez bioquímica, evolução da gravidez, taxa de implantação, taxa de gravidez ectópica.

   Variáveis ​​de controle: Fosforilação da tirosina (unidades de densidade óptica), PKA (unidades de densidade óptica), nitrosilação de proteínas (unidades de densidade óptica), nitratos e nitritos (unidades micromolares).

   Variáveis ​​descritivas: idade materna, idade paterna, etiologia masculina, etiologia feminina, IMC, tabagismo.

   H. Análise de dados

   Análise descritiva:

   Resumo estatístico dos dados coletados no estudo. Dados categóricos serão apresentados em tabelas de frequência e histogramas. Os valores contínuos serão resumidos com a média, desvio padrão e intervalo de confiança, serão representados por gráficos de quartis ou densidades.

   A análise exploratória dos dados permitirá avaliar a qualidade dos dados e a detecção de anomalias.

   Análise de homogeneidade:

   As médias e proporções das variáveis ​​descritivas (basais e demográficas) serão comparadas para validar o grau de comparabilidade dos grupos de estudo. Será aplicado o teste S qui-quadrado nas variáveis ​​categóricas e, assumindo que os dados seguem uma distribuição normal, um teste T nas variáveis ​​contínuas. Se os dados não seguissem uma distribuição normal, seria aplicado um teste de Mann-Whitney.

   No caso de encontrar variáveis ​​descritivas distribuídas de forma que existam diferenças estatísticas entre os grupos, elas serão incluídas em um modelo de regressão, para controlar sua interferência na relação principal a ser estudada.

   Comparação da expressão NO:

   Para validar uma hipótese de correlação de proporções na expressão do NO, será aplicado um teste de Fisher.

   Para avaliar o efeito de outras covariáveis ​​que podem modificar o comportamento da expressão do NO, será definido um modelo de regressão logística.

   Quanto à comparação da nitrosilação de proteínas, será aplicado o teste t de Student assumindo que os dados seguem uma distribuição normal. Caso não seja atendida a suposição de normalidade, verificada por um teste de Kolmogorov-Smirnof, seria aplicado um teste não paramétrico U-MannWhitney.

   Da mesma forma, será definido um modelo de regressão linear que permita avaliar o efeito de outras variáveis ​​correlacionadas.

   Avaliação da qualidade seminal:

   Para o conjunto de variáveis ​​que compõem a qualidade seminal, será aplicado um teste t-Student assumindo que os dados seguem uma distribuição normal. Caso não seja atendida a suposição de normalidade, verificada por um teste de Kolmogorov-Smirnof, seria aplicado um teste não paramétrico U-MannWhitney.

   Avaliação dos resultados gestacionais:

   Para o conjunto de variáveis ​​que definem os resultados da gestação, será aplicado um teste de Fisher.

   Plano de trabalho:

   Etapas de desenvolvimento e distribuição das tarefas de toda a equipe de pesquisa e das atribuições previstas para o corpo técnico. Indicar adicionalmente local/centro de realização do projeto.

   O desenho do estudo, bem como a redação do projeto, foram realizados pelos Doutores Carmen Matás Parra e Juan Carlos Martínez Soto.

   A equipe de ginecologistas que compõem a Unidade de Medicina Reprodutiva da clínica IVI Murcia, Dr. Jose Landeras, María Nicolás, Laura Fernández e Martina Trabalón, será responsável pela inclusão de pacientes e doadores de sêmen no estudo, bem como o responsável direto pelo tratamento de reprodução assistida realizado nos pacientes. Tal tratamento inclui: a escolha do tratamento a ser realizado, estimulação ovariana, procedimento de captação de ovócitos para coleta de ovócitos e fluido folicular, bem como transferência embrionária.

   Os embriologistas Marta Molla, David Gumbao, Julián Marcos, Beatriz Amorocho e Ana Isabel Sanchez serão os responsáveis ​​pelo processo de fertilização de ovócitos no laboratório de fertilização, bem como pela seleção dos embriões a serem transferidos.

   Florentin-Daniel Staicu, Carmen Matás Parra e Juan Carlos Martínez Soto farão a análise de amostras de fluido seminal e folicular. Estas análises serão realizadas tanto nas instalações da clínica IVI Murcia como nos laboratórios da Universidade de Murcia.

   O Dr. Jorge Chavarro conduzirá os estudos epidemiológicos e bioestatísticos.