Forholdet mellem nitrogenoxid (NO) i follikulær væske og sædbefrugtningsevne

Hovedformål:

Bestem ændringer i NOS-ekspressionen og proteinnitrosyleringen hos fertile og infertile patienter, når L-Arginin, substratet for NO-syntese, tilsættes til sædkapacitationsmediet i nærvær/fravær af human follikulær væske (hFF).

Sekundære mål:

1. Undersøg om virkningerne af hFF på sædkapacitet er forbundet med NO-niveauer i væsken.

2. Identificer sammenhængen mellem NO-niveauer i hFF og de kliniske resultater fra ART'er.

   METODOLOGI

   A. Population Populationen inkluderet i undersøgelsen vil omfatte både sæddonorer og par, der går på klinikken IVI Murcia til behandling af assisteret reproduktion via in vitro fertiliseringsteknikker.

   B. Inklusions-/eksklusionskriterier Afhængigt af målene kan både populationen og inklusions- og eksklusionskriterierne variere.

   Inklusionskriterier Hovedformål

   At undersøge ændringerne i NOS-ekspressionen samt proteinnitrosyleringen hos fertile og subfertile patienter. Til dette formål vil følgende grupper blive rekrutteret:

   • en gruppe af fertile hanner, såsom sæddonorer, der går på klinikken IVI Murcia;
   • en gruppe af subfertile mænd bestående af patienter, som går på klinikken IVI Murcia for at gennemgå en in vitro fertiliseringsbehandling, og som har en ændret spermiogramparameter ifølge WHO (2010) retningslinjer.

   For at nå de sekundære mål vil par, der gennemgår en IVF- eller ICSI-behandling blive inkluderet.

   Eksklusionskriterier Vil blive udelukket par, der gennemgår præimplantationsgenetisk diagnose, blev diagnosticeret med gentagne aborter (tre eller flere på hinanden følgende aborter før uge 20) eller implantationssvigt (manglende graviditet efter tre embryooverførsler med embryoner af god kvalitet hos kvinder under 36 år eller efter to embryooverførsler hos kvinder over 36 år) samt kvinder over 40 år.

   C. Prøvestørrelse:

   Da referenceværdier for NOS-ekspression ikke er tilgængelige, og da variabiliteten af ​​fordelingen af ​​progressive spermatozoer er høj, er det blevet bestemt, at for at påvise en forskel på 20 % i forhold til middelværdien i en bilateral test, med et signifikansniveau på 5% og 80% af den statistiske effekt, 41 sædprøver pr. gruppe vil være nødvendige. En periode på 24 måneder anslås at nå antallet af sædprøver.

   D. Eksperimentelt design og interventioner Biomedicinsk forskningsstudie med kontrolgruppe (fertile sæddonorer) og forsøgsgruppe (subfertile mænd)

   Interventioner:

   Sædprøver: opnås ved onani efter 2-7 dages seksuel afholdenhed. Alle prøver vil blive analyseret i henhold til WHOs retningslinjer (2010). For at undgå unødvendige besøg for de mænd, der er inkluderet i undersøgelsen, vil der blive anmodet om sædprøven under et af deres besøg på klinikken.

   Spermatozoer vil blive kapaciteret i tilstedeværelse og fravær af hFF. I et første sæt eksperimenter vil hFF blive suppleret med L-Arginin og NOS-hæmmeren L-NAME. I et andet sæt eksperimenter vil de samme tilskud til kapacitationsmediet blive undersøgt, men uden brug af hFF.

   En række teknikker såsom Western blot, in situ nitrosylering og Biotin Switch Assay vil blive brugt til at bestemme eventuelle ændringer i NOS-ekspressionen og proteinnitrosylering i spermatozoer. Western blot-teknikken vil også blive anvendt til at evaluere andre kapacitationsmarkører, såsom proteinkinase A (PKA) aktiviteten, tyrosinphosphorylering og tyrosinnitrering. Den samme behandling vil blive udført på alle sædprøver, uanset om de kommer fra patienter eller fra sæddonorer. I INGEN TILFÆLDE VIL DISSE SÆDPRØVER BRUGE TIL AT UDFØRE EN ASSISTERT REPRODUKTIONSBEHANDLING.

   Human follikelvæskeprøver:

   For at studere sammenhængen mellem NO-koncentrationen i follikelvæske og succesen med den assisterede reproduktionsbehandling, vil follikulærvæskeprøverne blive udtaget under oocytopsamlingsproceduren. Efter oocytfjernelse elimineres disse væsker normalt, men i dette tilfælde vil væskerne blive centrifugeret i 10 minutter ved 2000g og opbevaret ved -20°C indtil evaluering.

   NO-koncentrationen vil blive bestemt ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt målesystem. NO oxideres hurtigt til to stabile ioner, nemlig nitrit og nitrat, som kan analyseres ved at bruge ionselektive elektroder. Disse elektroder er blevet miniaturiseret for at kunne måle prøver ned til 30-40 µl med detektionsgrænser ned til det lave µM-område for begge arter.

   Western blot- og proteinnitrosyleringsassays vil blive udført inde i Animal Physiology-laboratoriet på University of Murcia (Fakultet for Veterinærmedicin).

   Det skal bemærkes, at det eneste formål med at analysere follikelvæsken er at undersøge efter den assisterede reproduktionsbehandling, om der er nogen sammenhæng mellem resultatet af behandlingen og NO-niveauerne. Der vil under ingen omstændigheder blive truffet beslutninger om embryooverførsel baseret på NO-niveauerne i follikulærvæsken.

   E. Indsamling af biologiske prøver Sperm- og follikelvæskeprøver vil blive evalueret i denne undersøgelse.

   • Formål med prøveindsamling De prøver, der indsamles i nærværende undersøgelse, vil kun blive brugt til gennemførelse af forskningsprojektet. Til hver biologisk prøve vil der blive tildelt en kode, som vil være uafhængig af NHC-koden (antal klinisk historie) for patienterne og kun kendes af forskerholdet. Dr. Juan Carlos Martínez Soto vil være ansvarlig for opbevaring og opbevaring af de biologiske prøver.
   • Metode til prøveudtagning De biologiske prøver udtages først, når patienten har underskrevet det tilsvarende informerede samtykke. Sædprøverne vil blive opnået ved onani efter 2-7 dages seksuel afholdenhed. For at undgå unødvendige forskydninger vil prøvetagningen finde sted under patientbesøget på klinikken.

   Follikulærvæskeprøverne vil blive udtaget på dagen for oocytopsamlingsproceduren udført til den in vitro fertiliseringsbehandling, som patienterne skal følge. Denne væske, som normalt kasseres, vil kun blive brugt til at bestemme NO-værdier.

   At opnå denne follikelvæske udgør ikke nogen yderligere risiko eller ubehag for dem, der er forårsaget af reproduktionsbehandlingen, da den kirurgiske procedure med oocytopsamling bruges til at opnå follikulærvæsken.

   • Metode til prøveidentifikation Sæd- og follikelvæskeprøverne vil blive identificeret på en måde, der gør det muligt at sikre deltagernes identitet.
   • Prøvekonservering Både sæd- og follikulærvæskeprøver vil blive opbevaret i frysere i Andrologilaboratoriet (IVI Murcia) ved -80°C indtil videre behandling, under opsyn af Dr. Juan Carlos Martínez Soto. Prøverne sendt til universitetet i Murcia vil blive opbevaret af Dr. Carmen Matás Parra. Både faciliteterne på University of Murcia og IVI-klinikkens faciliteter har begrænset adgang, derfor vil prøverne altid være bevogtet. Efter afslutning af undersøgelsen (januar 2019) vil overskudsprøverne blive destrueret efter klinikkens sædvanlige protokoller.

   F. Database Data vedrørende prøveanalyse (follikulær væske og sædprøver) vil blive lagret i Excel-tabeller i IVI Murcias faciliteter. Data vedrørende resultaterne af de assisterede reproduktionsbehandlinger, som er blevet fulgt af patienterne inkluderet i undersøgelsen, vil blive indhentet fra IVI management system (SIVIS).

   G. Undersøg variabler

   Fire klasser af variabler vil blive skelnet efter deres relevans i undersøgelsen:

   Primær variabel: INGEN niveauer.

   Sekundære variabler: NOS-udtryk, hastighed af progressiv sperm, graviditetsrate, biokemisk graviditet, graviditetsudvikling, implantationshastighed, ektopisk graviditetsrate.

   Kontrolvariabler: Tyrosin-phosphorylering (optiske densitetsenheder), PKA (optiske densitetsenheder), proteinnitrosylering (optiske densitetsenheder), nitrater og nitritter (mikromolære enheder).

   Beskrivende variabler: moderens alder, faderens alder, mandlig ætiologi, kvindelig ætiologi, BMI, rygevane.

   H. Dataanalyse

   Beskrivende analyse:

   Statistisk opsummering af data indsamlet i undersøgelsen. Kategoriske data vil blive præsenteret i frekvenstabeller og histogrammer. De kontinuerlige værdier vil blive opsummeret med middelværdien, standardafvigelsen og konfidensintervallet, de vil blive repræsenteret ved grafer af kvartiler eller tætheder.

   Den sonderende analyse af dataene vil gøre det muligt at vurdere kvaliteten af ​​dataene og påvisningen af ​​anomalier.

   Analyse af homogenitet:

   Middel og proportioner af de beskrivende variable (baseline og demografiske) vil blive sammenlignet for at validere graden af ​​sammenlignelighed af undersøgelsesgrupperne. S chi-kvadrattest vil blive anvendt i de kategoriske variable og, forudsat at data følger en normalfordeling, en T-test i de kontinuerte variable. Hvis dataene ikke følger en normal fordeling, vil en Mann-Whitney test blive anvendt.

   I tilfælde af at finde deskriptive variable fordelt på en måde, at der er statistiske forskelle mellem grupperne, vil de indgå i en regressionsmodel, for at kontrollere deres interferens i den hovedrelation, der skal undersøges.

   Sammenligning af NO-udtryk:

   For at validere en hypotese om korrelation af proportioner i NO-udtrykket, vil en Fisher-test blive anvendt.

   For at evaluere effekten af ​​andre kovariabler, der kan ændre adfærden af ​​NO-udtryk, vil en logistisk regressionsmodel blive defineret.

   Hvad angår sammenligningen af ​​proteinnitrosylering, vil en Students t-test blive anvendt under forudsætning af, at dataene følger en normalfordeling. Hvis normalitetsantagelsen ikke vil blive opfyldt, verificeret ved en Kolmogorov-Smirnof-test, vil en ikke-parametrisk U-MannWhitney-test blive anvendt.

   På samme måde vil der blive defineret en lineær regressionsmodel, der tillader evaluering af effekten af ​​andre korrelerede variable.

   Evaluering af sædkvalitet:

   For det sæt af variabler, der udgør den sædvanlige kvalitet, vil en t-Student-test blive anvendt, forudsat at dataene følger en normalfordeling. Hvis normalitetsantagelsen ikke vil blive opfyldt, verificeret ved en Kolmogorov-Smirnof-test, vil en ikke-parametrisk U-MannWhitney-test blive anvendt.

   Evaluering af svangerskabsresultater:

   For det sæt af variabler, der definerer graviditetsresultaterne, vil en Fisher-test blive anvendt.

   Arbejdsplan:

   Udviklingsfaser og fordeling af hele forskergruppens opgaver og de planlagte opgaver for det tekniske personale. Angiv desuden sted/center for projektets realisering.

   Designet af undersøgelsen, samt udarbejdelsen af ​​projektet er blevet udført af lægerne Carmen Matás Parra og Juan Carlos Martínez Soto.

   Holdet af gynækologer, der udgør Enheden for Reproduktiv Medicin på IVI Murcia-klinikken, Dr. Jose Landeras, María Nicolás, Laura Fernández og Martina Trabalón, vil være ansvarlige for inddragelsen af ​​patienter og sæddonorer i undersøgelsen, samt den direkte ansvarlige for den assisterede reproduktionsbehandling, der udføres på patienter. En sådan behandling omfatter: valg af behandling, der skal udføres, ovariestimulering, oocytopsamlingsprocedure til opsamling af oocytter og follikulær væske, samt embryooverførsel.

   Embryologerne Marta Molla, David Gumbao, Julián Marcos, Beatriz Amorocho og Ana Isabel Sanchez vil stå for processen med oocytbefrugtning i befrugtningslaboratoriet, samt udvælgelsen af ​​embryoner, der skal overføres.

   Florentin-Daniel Staicu, Carmen Matás Parra og Juan Carlos Martínez Soto vil udføre analysen af ​​både sæd- og follikelvæskeprøver. Disse analyser vil blive udført både i faciliteterne på IVI Murcia-klinikken og i laboratorierne på University of Murcia.

   Dr. Jorge Chavarro vil udføre de epidemiologiske og biostatistiske undersøgelser.