结直肠癌微卫星不稳定性导致的异常剪接：病理生理学和临床影响

WP1 - 识别在 MSI CRC 中特别受异常剪接事件影响的外显子/内含子连接点。 CNG 将首先使用 Illumina 的 Pipeline CASAVA（序列和变异的共识评估）软件对序列进行评估。 该程序将强度得分转换为碱基检出、质量得分比对和用于下游分析的其他格式，从而快速将数据转化为生物学相关信息。 然后将过滤后的数据传输到 CIT 平台（Carte d'Identité des Tumeurs；http://cit.ligue-cancer.net， dir: A. de Reynies) 将由我们的生物信息学专家进行分析。 Cufflinks 工作流程将用于量化 MSI 肿瘤中的转录本表达水平。 这允许在转录水平分辨率下进行转录组装、发现和差异表达测量。 由于标准 Cufflinks 工作流程不支持基因融合发现或量化，因此将在其中加入几个新功能。 首先，SoapFuse 将用于检测融合断裂点并预测融合连接序列。 这些将被整合到 Gencode 项目的人类参考基因组和基因注释中，为拼接读取的映射提供全面、集成的基因特征注释。 集成 INCa - PRTK 2014 17/51 流程将遵守多项规则，以尽量减少在即将进行的分析中干扰表达水平量化的可能性。 借助我们定制的参考基因组和注释，支持剪接点和基因融合作图的对齐器 TopHat 将用于 RNASeq 作图。 然后袖扣将用于寻找新的剪接变体，包括新的外显子跳跃异构体。

这些将使用 Cuffmerge 集成到注释中。 根据使用 TopHat 获得的比对结果，将应用多个过滤器来去除剪接变异和基因融合的低质量候选者，以及与现有注释转录本不兼容的候选者。 必要时，读取将由 AbySS 组装，然后由 BLAT 与参考基因组对齐，以提供更多信息以完善注释。 这将产生包含高置信度基因融合和外显子跳跃事件的转录组组装。 然后将在单个样本中识别这些事件。 Cuffdiff 将用于分析映射结果，也基于此转录组组装，用于调用差异表达的基因和转录本以及检测差异剪接变化。 最后，CummeRbund 将用于解释和可视化结果。

RNA-seq 分析的可靠性将通过搜索已经在 MSI 癌症（例如 MRE11 和 HSP110）和 MSI 靶基因编码序列（例如 TGFBR2、IGF2R、TCF7L2、AXIN2、PTEN、RIZ）和用作内部阳性对照的其他癌症相关基因（例如 KRAS、BRAF、TP53、PIK3CA）。 值得注意的是，该项目是与 CIT-Ligue 联合开发的其他几个项目的一部分，旨在使用组学技术表征 MSI CRC。 重要的是，该数据已经可用于大量样本，因此可以在需要时加以利用。

将对来自 RNASeq 患者队列的数据进行全面分析，以确定与 MSS CRC 和匹配的正常结肠粘膜相比，MSI 结肠肿瘤特异性发生的复发性剪接畸变（预计主要是外显子跳跃）。 其中，研究将重点关注由 MSI 引起并影响外显子的剪接畸变，该外显子的侧翼上游内含子包含一个 ≥ 15 bp LNCR，该 LNCR 距离内含子-外显子连接点（剪接受体位点）≤ 6 bp（RNASeqMSI-外显子预列表）。 如上所述，大约 2,000 个人类基因包含至少一个内含子，其 LNCR 非常靠近内含子-外显子连接处的 AG 剪接受体位点。 由于 CRC 中的 MSI，大约 100 个人类基因可能受到复发和特定异常剪接事件的影响（主要是外显子跳跃；从使用外显子阵列在有限系列的 CRC 细胞系和原发性肿瘤中进行的实验推断；初步和未发表的结果）。

WP2 - 调查 MSI 和异常剪接事件之间的功能联系。

在 RNASeq 分析之后，将需要使用另一种方法来确认由于 MSI 导致的异常剪接事件，以消除假阳性事件。 这将通过使用内部特异性探针（Applied biosystems）的实时定量 INCa - PRTK 2014 18/51 RT-PCR 来实现。 对于 RNASeqMSI 外显子预列表中的每个跳过的外显子，将设计一对位于侧翼外显子的通用正向和反向引物。

将设计两个内部探针，位于跳过的外显子内或跨越其连接处的侧翼外显子，以便分别以竞争方式检测正常或异常剪接的 mRNA。 它高度灵敏，还可避免因基因组 DNA 污染而产生的假阳性信号。 与 MSS CRC 对照相比，将保留的候选外显子是那些在 MSI CRC 细胞系和原发性肿瘤中显示异常和反复跳跃的外显子。

根据我们的工作假设，该研究随后将确定每个已确认的剪接畸变是否是由 MSI 驱动的。 这将如前所述针对 HSP110 内含子 8 中的 T17 缺失实现，这些缺失在 MSI CRC 中被明确识别并导致外显子 9 跳跃。 简言之，相邻内含子 LNCR（见上文）的等位基因谱将使用基于荧光的基因分型在 MSI 和 MSS CRC 细胞系以及来自 RNASeq 患者队列和配对正常的完整 MSI 原发性肿瘤系列中进行分析粘膜（以评估多态性状态）。 这将使用我们实验室早期开发的用于分析 HSP110 T17 DNA 重复序列的相同方法来执行。 在具有 GS400HD ROX 大小标准和 POP-7 聚合物（Applied Biosystems）的 ABI 3100 遗传分析仪上迁移 PCR 产物后，将使用 GeneMapper V4.0 软件（Applied Biosystems）分析 LNCR 痕迹，并应用 AFLP（扩增片段长度多态性）方法。 当峰值振幅在 100 到 6,000 荧光单位之间时，迹线将被认为是可接受的。 已经开发出 MSI Perl 脚本来自动比较正常和肿瘤样本中的 LNCR 痕迹，从而允许检测落在正常人群中观察到的多态性区域之外的异常 LNCR 峰。 与 HSP110 一样，预计 (i) 使用这种方法检测一些候选 LNCR 中的体细胞缺失/插入，以及 (ii) 识别那些由于 MSI 导致的体细胞改变与外显子跳跃相关事件显着相关的人RNA 水平（MSI 外显子最终列表）。

WP3 - 确定在 MSI CRC 患者中具有临床相关性的剪接事件和/或 LNCR 突变。 候选基因（MSI 外显子最终列表）的临床相关性将使用 RFS（无复发生存）的多变量生存回归模型进行评估。 候选剪接事件和/或 LNCR 突变的数量大约为 100（参见上面的 WP1 和 WP2）和 INCa - PRTK 2014 19/51 多变量模型中将考虑其他已知的临床决定因素，例如分期、治疗和诊断年龄。 误报是在数十个候选人中识别潜在相关标记的主要陷阱之一。 由于要考虑的协变量的数量 (p) 与个体数量的数量级相同，因此将达到“高维设置”。 因此，生存回归模型的常用算法（例如 R 中的 coxph）将无法估计参数并识别具有临床相关性的事件。 在我们的分析中，三个主要的方法论问题需要特别注意，尤其是在算法层面。

WP3 将分为两个主要步骤，第一个步骤涉及比较和统计算法的开发。 调整后，将运行算法以识别涉及剪接事件和/或具有临床相关性的 LNCR 突变的预后生物标志物。

高维回归模型和套索算法。 在第一步中，将仅考虑生存回归模型中的剪接突变和临床决定因素。 在这种情况下，变量选择和参数估计将使用套索（或弹性网）算法进行（Cox 模型参见 Simon 等人，Aalen 模型参见 Gaiffas 等人，两者均在 R 中实现）。

在以前的出版物中证明，在 HSP110 T17 LNCR 中具有大或小缺失的患者组之间以及由于 INCa - PRTK 外显子 9 跳跃导致突变体 HSP110 mRNA 高表达或低表达的患者组之间存在最大生存差异2014 20/51 mRNA 水平。 由于其他剪接事件可能会出现相同的阈值效应，因此将仔细确定多达 100 个候选剪接事件的切点。 即使在经典统计中，由于过度检测，切点确定也是一个众所周知的困难。 正如最近在相关上下文中提出的那样，“带预筛选算法的套索”可以适用于将切点确定合并到主要算法中。

其他要点。 缺失数据将通过最近邻或回归方法的多重插补处理。 该研究将考虑与使用化疗的可能相互作用。 作为最后一步，将对训练队列 (Saint-Antoine) 进行估计，以得出预后生物标志物，其中包括剪接事件和/或具有临床相关性的 LNCR 突变。 该生物标志物将在测试队列（多中心）上进行验证。 将进行 Bootstrap 分析以确定生物标志物。

WP4 - 开始对有限数量的临床相关癌症相关基因进行功能研究，这些基因的剪接在 MSI 癌细胞中受到高度干扰，并开发生物学工具以简化未来临床检测中的筛选。 如前所述，已使用外显子阵列对一小部分 MSI CRC 细胞系和原发性肿瘤（未发表）进行了初步研究。 这样做是为了评估可行性、时间、成本、不利因素、影响大小（统计变异性），并在执行当前的全面研究项目之前改进研究设计。 检测到的 100 个候选基因（其中一些可能与 RNAseq 筛选鉴定的基因重叠）的功能经常与癌症相关过程相关，例如大分子合成 (30%)、细胞增殖能力或细胞死亡 (20%)，耐药性 (10%) 和其他（WNT 通路、转移过程、染色体结构变化）。 目前的项目期望确定几个强大的 MSI 驱动的临床相关剪接突变体（参见上面的 WP2 和 WP3）。 这些突变体可能具有致癌或抗癌功能，因为某些突变体（如 HSP110）可能会以高水平产生，即使它们对肿瘤细胞有负面影响（参见我们上面关于 MSI 在 LNCR 中的预期有害影响的功能假设）钢筋混凝土）。 在这种情况下，将设计体外功能研究来表征少量 (n=5) 推定的临床相关突变体的致癌影响。 这些实验将基于使用 siRNA 或质粒的瞬时沉默或过表达，以及我们实验室已有的 CRC 细胞模型中的临时生物读出。

根据获得的结果，可以使用异种移植到裸鼠中的稳定转染的 CRC 模型来计划进一步的研究。 此外，该研究计划验证生物工具（例如 抗体）以优化未来使用常规检测的患者筛查，类似于我们对 HSP110 和 HSP110DE9 突变体的研究。 组织微阵列 (TMA) 将从圣安东尼医院病理科回顾性收集 INCa - PRTK 2014 21/51 的常规制备、福尔马林固定和石蜡包埋块构建。 将对肿瘤组织进行取样，包括肿瘤侵入前沿（3 至 6 个直径为 0.6 毫米的组织核心样本）。 如果可用，还将对成对的淋巴结转移进行取样。 将在 TMA 上使用特异性（分包）生成的抗体进行免疫组织化学识别野生型或突变候选蛋白。 外显子跳跃事件在 2/3 的病例中发生移码，因此产生具有免疫原性、异常 C 末端尾巴的截短蛋白质。 将评估蛋白质表达与临床病理特征之间的相关性，以及它们的预后和预测价值。 TMA 幻灯片图像将被捕获为高分辨率数字文件，并且每个染色的评估将由两名病理学家完成。