Afwijkende splitsingen als gevolg van microsatellietinstabiliteit bij colorectale kanker: fysiopathologische en klinische impact

WP1 - Om exon/intron-juncties te identificeren die specifiek worden beïnvloed door afwijkende splitsingsgebeurtenissen in MSI CRC. Sequenties zullen eerst worden geëvalueerd bij CNG met behulp van Illumina's Pipeline CASAVA-software (Consensus Assessment of Sequence And Variation). Dit programma zet intensiteitsscores om in basisoproepen, uitlijningen van kwaliteitsscores en aanvullende indelingen voor downstream-analyse, waardoor gegevens snel worden omgezet in biologisch relevante informatie. De gefilterde gegevens worden vervolgens overgebracht naar het CIT-platform (Carte d'Identité des Tumeurs; http://cit.ligue-cancer.net, dir: A. de Reynies) laten analyseren door onze bio-informatica-expert. De manchetknopen-workflow zal worden gebruikt om transcriptie-expressieniveaus in MSI-tumoren te kwantificeren. Dit maakt transcriptassemblage, ontdekking en differentiële expressiemetingen mogelijk met een resolutie op transcriptniveau. Omdat de standaard workflow voor manchetknopen geen ondersteuning biedt voor het ontdekken of kwantificeren van genfusies, zullen er verschillende nieuwe functies in worden opgenomen. Ten eerste zal SoapFuse worden gebruikt om fusiebreekpunten te detecteren en fusieovergangssequenties te voorspellen. Deze zullen worden geïntegreerd in het menselijke referentiegenoom en de genannotatie van het Gencode-project om een ​​uitgebreide, geïntegreerde annotatie van genkenmerken te bieden voor het in kaart brengen van splicing reads. Het integratieproces INCa - PRTK 2014 17/51 zal zich aan verschillende regels houden om de kans op verstoring van de kwantificering van het expressieniveau in toekomstige analyses tot een minimum te beperken. Met behulp van ons op maat gemaakte referentiegenoom en annotatie zal TopHat, een aligner die splice junction en genfusie-mapping ondersteunt, worden gebruikt voor RNASeq-mapping. Manchetknopen zullen vervolgens worden gebruikt om nieuwe splitsingsvarianten te vinden, waaronder nieuwe exon-skipping isovormen.

Deze worden met behulp van Cuffmerge in de annotatie geïntegreerd. Afhankelijk van de uitlijningsresultaten verkregen met TopHat, zullen verschillende filters worden toegepast om kandidaten van lage kwaliteit voor splitsingsvariatie en genfusie te verwijderen, evenals kandidaten die niet compatibel zijn met bestaande geannoteerde transcripten. Waar nodig worden reads geassembleerd door AbySS en vervolgens uitgelijnd op het referentiegenoom door BLAT om meer informatie te geven voor het verfijnen van de annotatie. Dit zal een transcriptoomassemblage produceren die zeer betrouwbare genfusie- en exon-skipping-gebeurtenissen bevat. Identificatie van deze gebeurtenissen zal dan worden uitgevoerd in individuele steekproeven. Cuffdiff zal worden gebruikt om het mappingresultaat te analyseren, ook op basis van deze transcriptoomassemblage, voor het aanroepen van differentieel tot expressie gebrachte genen en transcripten en voor het detecteren van differentiële splitsingsveranderingen. Ten slotte zal CummeRbund worden gebruikt om de resultaten te interpreteren en te visualiseren.

De betrouwbaarheid van RNA-seq-analyse zal worden geverifieerd door te zoeken naar afwijkend gesplitste transcripten die al zijn gerapporteerd in MSI-kankers (bijv. MRE11 en HSP110) en voor puntmutaties in de coderende sequenties van doelwitgenen voor MSI (bijv. TGFBR2, IGF2R, TCF7L2, AXIN2, PTEN, RIZ) en in andere kankergerelateerde genen die dienen als interne positieve controles (bijv. KRAS, BRAF, TP53, PIK3CA). Het is vermeldenswaard dat dit project deel uitmaakt van verschillende andere die samen met CIT-Ligue zijn ontwikkeld en die gericht zijn op het karakteriseren van MSI CRC met behulp van Omics-technologieën. Belangrijk is dat deze gegevens al beschikbaar zijn voor een aanzienlijk aantal monsters en daarom indien nodig kunnen worden gebruikt.

Gegevens van het RNASeq-cohort van patiënten zullen uitgebreid worden geanalyseerd om terugkerende splitsingsafwijkingen te identificeren (naar verwachting voornamelijk exon-skipping) die specifiek voorkomen bij MSI-colontumoren in vergelijking met MSS CRC's en overeenkomende normale colonmucosa. Hiervan zal de studie zich richten op splitsingsafwijkingen die het gevolg zijn van MSI en die exons beïnvloeden met een flankerend stroomopwaarts intron dat een ≥ 15 bp LNCR bevat die zich ≤ 6 bp van de intron-exon-junctie bevindt (splitsingsacceptorplaats) (RNASeqMSI- exon voorlijst). Zoals hierboven vermeld, bevatten ongeveer 2.000 menselijke genen ten minste één intron met een LNCR zeer dicht bij de AG-splitsingsacceptorplaats op de intron-exon-overgang. Ongeveer 100 menselijke genen kunnen worden beïnvloed door terugkerende en specifieke afwijkende splitsingsgebeurtenissen als gevolg van MSI in CRC (meestal exon skipping; afgeleid uit experimenten uitgevoerd in een beperkte reeks CRC-cellijnen en primaire tumoren met behulp van exon-arrays; voorlopige en niet-gepubliceerde resultaten).

WP2 - Onderzoeken naar functionele verbanden tussen MSI en afwijkende splitsingsgebeurtenissen.

Na de RNASeq-analyse is bevestiging van de afwijkende splitsingsgebeurtenissen als gevolg van MSI vereist met behulp van een andere methodologische benadering om fout-positieve gebeurtenissen te elimineren. Dit zal worden bereikt met realtime kwantitatieve INCa - PRTK 2014 18/51 RT-PCR met behulp van interne, specifieke sondes (Applied biosystems). Voor elk overgeslagen exon in de prelijst van RNASeqMSI-exon wordt een gemeenschappelijk paar voorwaartse en achterwaartse primers in de flankerende exons ontworpen.

Er zullen twee interne sondes worden ontworpen, ofwel gelokaliseerd in de overgeslagen exons of die de flankerende exons bij hun verbinding overspannen om respectievelijk normaal of afwijkend gesplitst mRNA op een competitieve manier te detecteren. Het is zeer gevoelig en vermijdt ook valse positieve signalen als gevolg van besmetting met genomisch DNA. Kandidaat-exons die zullen worden behouden, zijn die welke afwijkende en terugkerende overslaan vertonen in MSI CRC-cellijnen en primaire tumoren in vergelijking met MSS CRC-controles.

In overeenstemming met onze werkhypothese zal de studie vervolgens bepalen of elke bevestigde splitsingsafwijking MSI-gestuurd is. Dit zal worden bereikt zoals eerder beschreven voor T17-deleties in intron 8 van HSP110 die specifiek werden geïdentificeerd in MSI CRC en leidden tot het overslaan van exon 9. In het kort zullen allelische profielen van aangrenzende intronische LNCR (zie hierboven) worden geanalyseerd met behulp van op fluorescentie gebaseerde genotypering in het panel van MSI- en MSS CRC-cellijnen, evenals in de volledige reeks MSI-primaire tumoren van het RNASeq-patiëntencohort en gepaarde normale tumoren. slijmvlies (om de polymorfe status te beoordelen). Dit zal worden uitgevoerd met behulp van dezelfde methode die eerder in ons laboratorium is ontwikkeld voor analyse van de HSP110 T17 DNA-herhaling. Na migratie van PCR-producten op een ABI 3100 Genetic Analyzer met GS400HD ROX-maatstandaarden en POP-7-polymeer (Applied Biosystems), zal GeneMapper V4.0-software (Applied Biosystems) worden gebruikt om LNCR-sporen te analyseren, met toepassing van een AFLP (Amplified Fragmentlengte polymorfisme) methode. Sporen worden als acceptabel beschouwd wanneer de piekamplitudes tussen 100 en 6.000 fluorescentie-eenheden liggen. Er is een MSI Perl-script ontwikkeld om automatisch LNCR-sporen in normale en tumormonsters te vergelijken, waardoor detectie mogelijk wordt van afwijkende LNCR-pieken die buiten de polymorfe zone vallen die wordt waargenomen in de normale populatie. Net als bij HSP110 wordt verwacht dat (i) somatische deleties/inserties worden gedetecteerd in sommige van de kandidaat-LNCR's met behulp van deze benadering, en (ii) diegenen worden geïdentificeerd wiens somatische veranderingen als gevolg van MSI significant geassocieerd zijn met exon-skipping-gerelateerde gebeurtenissen op de RNA-niveau (MSI exon definitieve lijst).

WP3 - Om splitsingsgebeurtenissen en/of LNCR-mutaties te identificeren met klinische relevantie bij MSI CRC-patiënten. De klinische relevantie van kandidaatgenen (MSI exon final list) zal worden beoordeeld met behulp van multivariate overlevingsregressiemodellen voor RFS (Relapse-Free Survival). Het aantal kandidaat-splitsingsgebeurtenissen en/of LNCR-mutaties is ongeveer 100 (zie WP1 en WP2 hierboven) en INCa - PRTK 2014 19/51 andere bekende klinische determinanten zoals stadium, behandeling en leeftijd bij diagnose zullen worden overwogen in de multivariate modellen. Valse positieven zijn een van de grootste valkuilen bij het identificeren van potentieel relevante markers onder tientallen kandidaten. Aangezien het aantal (p) covariabelen dat in aanmerking moet worden genomen van dezelfde orde zal zijn als het aantal individuen, zal de "hoog-dimensionale setting" worden bereikt. Bijgevolg zijn de gebruikelijke algoritmen voor overlevingsregressiemodellen (bijv. coxph in R) zal er niet in slagen de parameters in te schatten en gebeurtenissen met klinische relevantie te identificeren. In onze analyse vragen drie belangrijke methodologische kwesties speciale aandacht, met name op algoritmisch niveau.

WP3 zal worden onderverdeeld in twee hoofdstappen, waarvan de eerste betrekking heeft op vergelijkingen en de ontwikkeling van statistische algoritmen. Eenmaal afgestemd, zullen de algoritmen worden uitgevoerd om een ​​prognostische biomarker(s) te identificeren die splitsingsgebeurtenissen en/of LNCR-mutaties met klinische relevantie omvat.

Hoogdimensionale regressiemodellen en lasso-algoritmen. In de eerste stap zullen alleen splicing-mutaties en klinische determinanten in de overlevingsregressiemodellen worden overwogen. In dit geval zullen variabeleselectie en parameterschatting worden uitgevoerd met een lasso-algoritme (of elastisch net) (zie Simon et al. voor het Cox-model en Gaiffas et al. voor het Aalen-model, beide geïmplementeerd in R).

In eerdere publicaties werd aangetoond dat cut-point waarden resulteerden in maximale overlevingsverschillen tussen patiëntengroepen met grote of kleine deleties in de HSP110 T17 LNCR, en met hoge of lage expressie van mutant HSP110 mRNA als gevolg van exon 9 skipping bij de INCa - PRTK 2014 20/51 mRNA-niveau. Aangezien andere splitsingsgebeurtenissen hetzelfde drempeleffect kunnen hebben, zullen de afkappunten voor maximaal 100 kandidaat-splitsingsgebeurtenissen zorgvuldig worden bepaald. Zelfs in de klassieke statistiek is het bepalen van het afkappunt een bekende moeilijkheid vanwege overdetectie. Zoals onlangs voorgesteld in een verwante context, zou de "lasso met pre-screening-algoritme" kunnen worden aangepast om de bepaling van het afkappunt op te nemen in het hoofdalgoritme.

Andere punten. Ontbrekende gegevens worden afgehandeld door middel van meerdere imputaties van naaste buren of regressiemethoden. De studie zal mogelijke interacties met het gebruik van chemotherapie overwegen. Als laatste stap zullen schattingen worden uitgevoerd op het trainingscohort (Saint-Antoine) om een ​​prognostische biomarker af te leiden die splitsingsgebeurtenissen en/of LNCR-mutaties met klinische relevantie zal omvatten. Deze biomarker zal worden gevalideerd op het testcohort (multicenter). Bootstrap-analyse zal worden uitgevoerd om de biomarker vast te stellen.

WP4 - Initiëren van functionele studies van een beperkt aantal klinisch relevante, kankergerelateerde genen waarvan de splicing sterk verstoord is in MSI-kankercellen, en het ontwikkelen van biologische tools om screening in toekomstige klinische assays te vereenvoudigen. Zoals eerder vermeld, is er een vooronderzoek uitgevoerd met behulp van exon-arrays in een kleine reeks MSI CRC-cellijnen en primaire tumoren (niet gepubliceerd). Dit werd uitgevoerd om haalbaarheid, tijd, kosten, ongunstige factoren, effectgrootte (statistische variabiliteit) te evalueren en om het onderzoeksontwerp te verbeteren voorafgaand aan de uitvoering van het huidige volledige onderzoeksproject. De functies van de 100 gedetecteerde kandidaatgenen (waarvan sommige kunnen overlappen met die geïdentificeerd uit RNAseq-screening) waren vaak gerelateerd aan kankergerelateerde processen zoals macromoleculaire synthese (30%), celproliferatiecapaciteit of celdood (20%), geneesmiddelresistentie (10%) en andere (WNT-route, metastatisch proces, veranderingen in chromosoomstructuur). Het huidige project verwacht verschillende robuuste MSI-gestuurde splitsingsmutanten te identificeren die klinisch relevant zijn (zie WP2 en WP3 hierboven). Deze mutanten kunnen zowel oncogene als anticogene functies hebben, aangezien sommige (zoals HSP110) in hoge concentraties kunnen worden geproduceerd, ook al hebben ze een negatief effect op de tumorcel (zie onze functionele hypothese hierboven met betrekking tot de verwachte nadelige invloed van MSI op LNCR in CRC). In deze context zullen in vitro functionele studies worden opgezet om de oncogene impact van een klein aantal (n=5) vermeende klinisch relevante mutanten te karakteriseren. Deze experimenten zullen gebaseerd zijn op tijdelijke silencing of overexpressie met behulp van siRNA of plasmiden en ad hoc biologische uitlezing in cellulaire CRC-modellen die al beschikbaar zijn in ons laboratorium.

Afhankelijk van de verkregen resultaten, kunnen verdere onderzoeken worden gepland met behulp van stabiel getransfecteerde CRC-modellen die xenograft zijn in naakte muizen. Bovendien moet het studieplan om biologische instrumenten te valideren (bijv. Antilichamen) om de toekomstige screening van patiënten te optimaliseren met behulp van routinetesten, vergelijkbaar met ons werk met HSP110 en de HSP110DE9-mutant. Tissue Microarrays (TMA's) zullen worden geconstrueerd uit routinematig geprepareerde, in formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde blokken die retrospectief zijn verzameld INCa - PRTK 2014 21/51 van de afdeling Pathologie van het Saint-Antoine-ziekenhuis. Neoplastisch weefsel zal worden bemonsterd, inclusief het invasieve front van de tumor (3 tot 6 monsters van weefselkernen met een diameter van 0,6 mm). Indien beschikbaar zal ook gepaarde lymfekliermetastasen worden bemonsterd. Immunohistochemie met antilichamen die specifiek worden gegenereerd (uitbesteding) om wildtype of mutante kandidaat-eiwitten te herkennen, zal worden uitgevoerd op TMA's. Exon-skipping-gebeurtenissen zijn in 2/3 van de gevallen frameshift en genereren dus afgeknotte eiwitten met immunogene, afwijkende C-terminale staarten. Correlaties tussen eiwitexpressie en klinisch-pathologische kenmerken zullen worden geëvalueerd, evenals hun prognostische en voorspellende waarden. TMA-diabeelden worden vastgelegd als digitale bestanden met hoge resolutie en evaluatie van elke kleuring wordt uitgevoerd door twee pathologen.