Abweichende Spleiße aufgrund von Mikrosatelliten-Instabilität bei Darmkrebs: Physiopathologische und klinische Auswirkungen

WP1 – Identifizierung von Exon/Intron-Übergängen, die spezifisch von abweichenden Spleißereignissen in MSI-CRC betroffen sind. Die Sequenzen werden zunächst bei CNG unter Verwendung der Pipeline-CASAVA-Software (Consensus Assessment of Sequence And Variation) von Illumina bewertet. Dieses Programm wandelt Intensitätswerte in Base-Calls, qualitätsbewertete Alignments und zusätzliche Formate für nachgelagerte Analysen um und wandelt so Daten schnell in biologisch relevante Informationen um. Die gefilterten Daten werden dann an die CIT-Plattform (Carte d'Identité des Tumeurs; http://cit.ligue-cancer.net, dir: A. de Reynies) zur Analyse durch unseren Bioinformatik-Experten. Der Manschettenknöpfe-Workflow wird zur Quantifizierung der Transkript-Expressionsniveaus in MSI-Tumoren verwendet. Dies ermöglicht die Zusammenstellung, Entdeckung und differenzielle Expression von Transkripten mit einer Auflösung auf Transkriptebene. Da der standardmäßige Manschettenknöpfe-Workflow die Entdeckung oder Quantifizierung von Genfusionen nicht unterstützt, werden mehrere neue Funktionen darin integriert. Erstens wird SoapFuse verwendet, um Fusionsbruchstellen zu erkennen und Fusionsverbindungssequenzen vorherzusagen. Diese werden in das menschliche Referenzgenom und die Genannotation aus dem Gencode-Projekt integriert, um eine umfassende, integrierte Annotation von Genmerkmalen für die Kartierung von Splicing-Reads bereitzustellen. Der Integrationsprozess wird sich an mehrere Regeln halten, um das Potenzial zu minimieren, die Quantifizierung des Expressionsniveaus in bevorstehenden Analysen zu stören. Mit Hilfe unseres angepassten Referenzgenoms und unserer Annotation TopHat wird ein Aligner, der Spleißstellen und Genfusionskartierung unterstützt, für die RNASeq-Kartierung verwendet. Manschettenknöpfe werden dann verwendet, um neue Spleißvarianten zu finden, einschließlich neuer Exon-Skipping-Isoformen.

Diese werden per Cuffmerge in die Annotation integriert. Abhängig von den mit TopHat erzielten Alignment-Ergebnissen werden mehrere Filter angewendet, um Kandidaten geringer Qualität für Spleißvariationen und Genfusionen sowie Kandidaten, die mit bestehenden annotierten Transkripten nicht kompatibel sind, zu entfernen. Bei Bedarf werden Reads von AbySS zusammengestellt und dann von BLAT mit dem Referenzgenom abgeglichen, um weitere Informationen zur Verfeinerung der Annotation bereitzustellen. Dadurch wird eine Transkriptom-Anordnung erzeugt, die hochgradig zuverlässige Genfusions- und Exon-Skipping-Ereignisse enthält. Die Identifizierung dieser Ereignisse wird dann in einzelnen Proben durchgeführt. Cuffdiff wird verwendet, um das Kartierungsergebnis zu analysieren, das ebenfalls auf dieser Transkriptomanordnung basiert, um differenziell exprimierte Gene und Transkripte zu nennen und differenzielle Splicing-Änderungen zu erkennen. Schließlich wird CummeRbund verwendet, um die Ergebnisse zu interpretieren und zu visualisieren.

Die Verlässlichkeit der RNA-Seq-Analyse wird verifiziert, indem nach abweichend gespleißten Transkripten gesucht wird, die bereits bei MSI-Krebserkrankungen (z. MRE11 und HSP110) und für Punktmutationen in den kodierenden Sequenzen von Zielgenen für MSI (z. B. TGFBR2, IGF2R, TCF7L2, AXIN2, PTEN, RIZ) und in anderen krebsbezogenen Genen, die als interne Positivkontrollen dienen (z. KRAS, BRAF, TP53, PIK3CA). Es ist erwähnenswert, dass dieses Projekt Teil mehrerer anderer ist, die gemeinsam mit CIT-Ligue entwickelt wurden und darauf abzielen, MSI CRC mithilfe von Omics-Technologien zu charakterisieren. Wichtig ist, dass diese Daten bereits für eine beträchtliche Anzahl von Proben verfügbar sind und daher bei Bedarf genutzt werden könnten.

Daten aus der RNASeq-Patientenkohorte werden umfassend analysiert, um wiederkehrende Splicing-Aberrationen (voraussichtlich hauptsächlich Exon-Skipping) zu identifizieren, die speziell bei MSI-Darmtumoren im Vergleich zu MSS-CRCs und passender normaler Dickdarmschleimhaut auftreten. Unter diesen wird sich die Studie auf Spleißaberrationen konzentrieren, die auf MSI zurückzuführen sind und die Exons mit einem flankierenden stromaufwärts gelegenen Intron betreffen, das einen ≥ 15 bp LNCR enthält, der ≤ 6 bp von der Intron-Exon-Verbindung (Spleißakzeptorstelle) entfernt liegt (RNASeqMSI- Exon-Vorliste). Wie oben angegeben, enthalten etwa 2.000 menschliche Gene mindestens ein Intron mit einem LNCR sehr nahe an der AG-Spleißakzeptorstelle an der Intron-Exon-Verbindung. Ungefähr 100 menschliche Gene könnten von wiederkehrenden und spezifischen aberranten Spleißereignissen aufgrund von MSI bei CRC betroffen sein (hauptsächlich Exon-Skipping; abgeleitet von Experimenten, die in einer begrenzten Reihe von CRC-Zelllinien und Primärtumoren unter Verwendung von Exon-Arrays durchgeführt wurden; vorläufige und unveröffentlichte Ergebnisse).

WP2 – Untersuchung funktioneller Zusammenhänge zwischen MSI und abweichenden Spleißereignissen.

Nach der RNASeq-Analyse ist eine Bestätigung der abweichenden Splicing-Ereignisse aufgrund von MSI mithilfe eines anderen methodischen Ansatzes erforderlich, um falsch positive Ereignisse zu eliminieren. Dies wird mit quantitativer Echtzeit-RT-PCR INCa - PRTK 2014 18/51 unter Verwendung interner, spezifischer Sonden (Applied Biosystems) erreicht. Für jedes übersprungene Exon in der RNASeqMSI-Exon-Prelist wird ein gemeinsames Paar von Forward- und Reverse-Primern in den flankierenden Exons entworfen.

Es werden zwei interne Sonden entwickelt, die sich entweder innerhalb der übersprungenen Exons befinden oder die flankierenden Exons an ihrer Verbindungsstelle überspannen, um normal bzw. anormal gespleißte mRNA kompetitiv nachzuweisen. Es ist hochempfindlich und vermeidet auch falsch positive Signale durch Kontamination mit genomischer DNA. Kandidaten-Exons, die beibehalten werden, sind solche, die im Vergleich zu MSS-CRC-Kontrollen ein aberrantes und wiederkehrendes Skipping in MSI-CRC-Zelllinien und Primärtumoren aufweisen.

In Übereinstimmung mit unserer Arbeitshypothese wird die Studie dann feststellen, ob jede bestätigte Spleißabweichung MSI-bedingt ist. Dies wird erreicht, wie zuvor für T17-Deletionen in Intron 8 von HSP110 beschrieben, die spezifisch in MSI-CRC identifiziert wurden und zu Exon-9-Skipping führen. Kurz gesagt, Allelprofile benachbarter intronischer LNCR (siehe oben) werden mithilfe von fluoreszenzbasierter Genotypisierung im Panel der MSI- und MSS-CRC-Zelllinien sowie in der vollständigen Serie von MSI-Primärtumoren aus der RNASeq-Patientenkohorte und gepaarten Normalen analysiert Schleimhaut (um den polymorphen Status zu beurteilen). Dies wird unter Verwendung derselben Methode durchgeführt, die zuvor in unserem Labor für die Analyse der HSP110 T17-DNA-Wiederholung entwickelt wurde. Nach der Migration von PCR-Produkten auf einem ABI 3100 Genetic Analyzer mit GS400HD ROX-Größenstandards und POP-7-Polymer (Applied Biosystems) wird die Software GeneMapper V4.0 (Applied Biosystems) verwendet, um LNCR-Spuren mit Anwendung eines AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)-Verfahren. Spuren werden als akzeptabel angesehen, wenn die Spitzenamplituden zwischen 100 und 6.000 Fluoreszenzeinheiten liegen. Ein MSI-Perl-Skript wurde entwickelt, um LNCR-Spuren in normalen und Tumorproben automatisch zu vergleichen und so abweichende LNCR-Peaks zu erkennen, die außerhalb der in der normalen Population beobachteten polymorphen Zone liegen. Wie bei HSP110 wird erwartet, dass (i) somatische Deletionen/Insertionen in einigen der Kandidaten-LNCRs unter Verwendung dieses Ansatzes nachgewiesen werden und (ii) diejenigen identifiziert werden, deren somatische Veränderungen aufgrund von MSI signifikant mit Exon-Skipping-bezogenen Ereignissen am assoziiert sind RNA-Level (endgültige MSI-Exon-Liste).

WP3 – Identifizierung von Spleißereignissen und/oder LNCR-Mutationen mit klinischer Relevanz bei MSI-CRC-Patienten. Die klinische Relevanz von Kandidatengenen (MSI Exon Final List) wird anhand von multivariaten Überlebensregressionsmodellen für RFS (Relapse-Free Survival) bewertet. Die Anzahl der möglichen Spleißereignisse und/oder LNCR-Mutationen beträgt etwa 100 (siehe WP1 und WP2 oben) und INCa - PRTK 2014 19/51 andere bekannte klinische Determinanten wie Stadium, Behandlung und Alter bei der Diagnose werden in den multivariaten Modellen berücksichtigt. Fehlalarme sind eine der größten Fallstricke bei der Identifizierung potenziell relevanter Marker unter Dutzenden von Kandidaten. Da die Anzahl (p) der zu berücksichtigenden Kovariaten in der gleichen Größenordnung wie die Anzahl der Individuen liegt, wird die "hochdimensionale Einstellung" erreicht. Folglich sind die üblichen Algorithmen für Survival-Regressionsmodelle (z. coxph in R) wird es versäumen, die Parameter abzuschätzen und Ereignisse mit klinischer Relevanz zu identifizieren. In unserer Analyse erfordern drei methodische Hauptprobleme besondere Aufmerksamkeit, insbesondere auf algorithmischer Ebene.

WP3 wird in zwei Hauptschritte unterteilt, von denen der erste Vergleiche und die Entwicklung statistischer Algorithmen betrifft. Nach der Abstimmung werden die Algorithmen ausgeführt, um einen oder mehrere prognostische Biomarker zu identifizieren, die Spleißereignisse und/oder LNCR-Mutationen mit klinischer Relevanz beinhalten.

Hochdimensionale Regressionsmodelle und Lasso-Algorithmen. Im ersten Schritt werden nur Spleißmutationen und klinische Determinanten in den Überlebensregressionsmodellen berücksichtigt. In diesem Fall werden Variablenauswahl und Parameterschätzung mit einem Lasso- (oder elastischen Netz-) Algorithmus durchgeführt (siehe Simon et al. für das Cox-Modell und Gaiffas et al. für das Aalen-Modell, beide in R implementiert).

In früheren Veröffentlichungen wurde gezeigt, dass Cut-Point-Werte zu maximalen Überlebensunterschieden zwischen Patientengruppen mit großen oder kleinen Deletionen im HSP110 T17 LNCR und mit hoher oder niedriger Expression mutanter HSP110-mRNA aufgrund von Exon 9-Skipping am INCa - PRTK führten 2014 20/51 mRNA-Level. Da andere Spleißereignisse denselben Schwelleneffekt aufweisen könnten, werden die Schnittpunkte für bis zu 100 Kandidaten-Spleißereignisse sorgfältig bestimmt. Auch in der klassischen Statistik ist die Cut-Point-Bestimmung wegen Überdetektion eine bekannte Schwierigkeit. Wie kürzlich in einem verwandten Kontext vorgeschlagen, könnte das "Lasso mit Vorab-Screening-Algorithmus" angepasst werden, um die Bestimmung des Schnittpunkts in den Hauptalgorithmus aufzunehmen.

Andere Punkte. Fehlende Daten werden durch mehrfache Imputationen aus Nächster-Nachbar- oder Regressionsmethoden behandelt. Die Studie wird mögliche Wechselwirkungen mit der Anwendung einer Chemotherapie berücksichtigen. Als letzter Schritt werden Schätzungen an der Trainingskohorte (Saint-Antoine) durchgeführt, um einen prognostischen Biomarker abzuleiten, der Spleißereignisse und/oder LNCR-Mutationen mit klinischer Relevanz umfasst. Dieser Biomarker wird an der Testkohorte (multizentrisch) validiert. Zur Bestimmung des Biomarkers wird eine Bootstrap-Analyse durchgeführt.

WP4 - Initiierung funktioneller Studien an einer begrenzten Anzahl klinisch relevanter, krebsbezogener Gene, deren Spleißen in MSI-Krebszellen stark gestört ist, und Entwicklung biologischer Werkzeuge zur Vereinfachung des Screenings in zukünftigen klinischen Assays. Wie bereits erwähnt, wurde eine vorläufige Studie unter Verwendung von Exon-Arrays in einer kleinen Serie von MSI-CRC-Zelllinien und Primärtumoren durchgeführt (unveröffentlicht). Dies wurde durchgeführt, um Machbarkeit, Zeit, Kosten, nachteilige Faktoren, Effektgröße (statistische Variabilität) zu bewerten und das Studiendesign vor der Durchführung des vorliegenden umfassenden Forschungsprojekts zu verbessern. Die Funktionen der 100 nachgewiesenen Kandidatengene (von denen sich einige mit denen aus dem RNAseq-Screening identifizierten überschneiden können) standen häufig im Zusammenhang mit krebsbedingten Prozessen wie makromolekularer Synthese (30 %), Zellproliferationsfähigkeit oder Zelltod (20 %). Arzneimittelresistenz (10%) und andere (WNT-Weg, Metastasierungsprozess, Veränderungen in der Chromosomenstruktur). Das vorliegende Projekt erwartet die Identifizierung mehrerer robuster MSI-gesteuerter Splice-Mutanten, die klinisch relevant sind (siehe AP2 und AP3 oben). Diese Mutanten könnten entweder onkogene oder antionkogene Funktionen haben, da einige (wie HSP110) in hohen Mengen produziert werden können, obwohl sie negative Auswirkungen auf die Tumorzelle haben (siehe unsere funktionelle Hypothese oben bezüglich des erwarteten schädlichen Einflusses von MSI bei LNCR in KRK). In diesem Zusammenhang werden funktionelle In-vitro-Studien konzipiert, um die onkogene Wirkung einer kleinen Anzahl (n=5) mutmaßlich klinisch relevanter Mutanten zu charakterisieren. Diese Experimente basieren auf vorübergehendem Silencing oder Überexpression unter Verwendung von siRNA oder Plasmiden und Ad-hoc-biologischem Auslesen in CRC-Zellmodellen, die bereits in unserem Labor verfügbar sind.

Abhängig von den erhaltenen Ergebnissen könnten dann weitere Untersuchungen unter Verwendung stabil transfizierter CRC-Modelle geplant werden, die in Nacktmäuse xenotransplantiert wurden. Darüber hinaus ist der Studienplan zur Validierung biologischer Werkzeuge (z. Antikörper), um das zukünftige Screening von Patienten mithilfe von Routineassays zu optimieren, ähnlich unserer Arbeit mit HSP110 und der HSP110DE9-Mutante. Tissue Microarrays (TMAs) werden aus routinemäßig präparierten, formalinfixierten und in Paraffin eingebetteten Blöcken konstruiert, die rückwirkend von der pathologischen Abteilung des Saint-Antoine-Krankenhauses gesammelt wurden. Neoplastisches Gewebe wird entnommen, einschließlich der tumorinvasiven Front (3 bis 6 Proben von Gewebekernen mit einem Durchmesser von 0,6 mm). Wenn verfügbar, werden auch gepaarte Lymphknotenmetastasen entnommen. An TMAs wird Immunhistochemie mit spezifisch erzeugten Antikörpern (Unterauftrag) zur Erkennung von Wildtyp- oder mutierten Kandidatenproteinen durchgeführt. Exon-Skipping-Ereignisse sind Frameshifts in 2/3 der Fälle und erzeugen somit verkürzte Proteine ​​mit immunogenen, aberranten C-terminalen Schwänzen. Korrelationen zwischen Proteinexpression und klinisch-pathologischen Merkmalen sowie ihre prognostischen und prädiktiven Werte werden evaluiert. TMA-Objektträgerbilder werden als hochauflösende digitale Dateien erfasst und die Auswertung jeder Färbung wird von zwei Pathologen vorgenommen.