Splicings Aberrantes Devido à Instabilidade de Microssatélites no Câncer Colorretal: Impacto Fisiopatológico e Clínico

WP1 - Identificar junções de exon/intron que são especificamente afetadas por eventos de splicing aberrante no MSI CRC. As sequências serão primeiro avaliadas no CNG usando o software Pipeline CASAVA (Avaliação de Consenso de Sequência e Variação) da Illumina. Este programa converte pontuações de intensidade em chamadas de base, alinhamentos pontuados de qualidade e formatos adicionais para análise a jusante, transformando rapidamente os dados em informações biologicamente relevantes. Os dados filtrados serão então transferidos para a plataforma CIT (Carte d'Identité des Tumeurs; http://cit.ligue-cancer.net, dir: A. de Reynies) para ser analisado pelo nosso especialista em bioinformática. O fluxo de trabalho Cufflinks será usado para quantificar os níveis de expressão de transcrição em tumores MSI. Isso permite medidas de montagem, descoberta e expressão diferencial de transcrição na resolução em nível de transcrição. Como o fluxo de trabalho padrão do Cufflinks não oferece suporte à descoberta ou quantificação de fusão de genes, vários novos recursos serão incorporados a ele. Em primeiro lugar, o SoapFuse será usado para detectar pontos de quebra de fusão e prever sequências de junções de fusão. Estes serão integrados no genoma humano de referência e na anotação do gene do projeto Gencode para fornecer uma anotação abrangente e integrada das características do gene para mapeamento de leituras de splicing. O processo de integração INCa - PRTK 2014 17/51 obedecerá a diversas regras para minimizar o potencial de perturbar a quantificação do nível de expressão nas próximas análises. Com a ajuda de nosso genoma de referência personalizado e anotação, TopHat, um alinhador que suporta junção de splice e mapeamento de fusão de genes será usado para o mapeamento de RNASeq. Abotoaduras serão usadas para encontrar novas variantes de emenda, incluindo novas isoformas de salto de exon.

Estes serão integrados na anotação usando Cuffmerge. Dependendo dos resultados de alinhamento obtidos com o TopHat, vários filtros serão aplicados para remover candidatos de baixa qualidade para variação de splicing e fusão de genes, bem como candidatos incompatíveis com os transcritos anotados existentes. Onde necessário, as leituras serão montadas pelo AbySS e então alinhadas no genoma de referência pelo BLAT para fornecer mais informações para refinar a anotação. Isso produzirá um conjunto de transcriptoma contendo fusão de genes de alta confiança e eventos de salto de exon. A identificação desses eventos será então realizada em amostras individuais. Cuffdiff será usado para analisar o resultado do mapeamento, também baseado nesta montagem do transcriptoma, para chamar genes e transcritos diferencialmente expressos e para detectar alterações de splicing diferencial. Finalmente, o CummeRbund será usado para interpretar e visualizar os resultados.

A confiabilidade da análise de RNA-seq será verificada pela busca de transcritos com splicing aberrante já relatados em cânceres MSI (por exemplo. MRE11 e HSP110) e para mutações pontuais nas sequências de codificação de genes alvo para MSI (por exemplo, TGFBR2, IGF2R, TCF7L2, AXIN2, PTEN, RIZ) e em outros genes relacionados ao câncer que servem como controles positivos internos (por exemplo, KRAS, BRAF, TP53, PIK3CA). De referir que este projeto faz parte de vários outros desenvolvidos em conjunto com o CIT-Ligue e que visam a caracterização do MSI CRC utilizando tecnologias Omics. É importante ressaltar que esses dados já estão disponíveis para um número significativo de amostras e, portanto, podem ser explorados, se necessário.

Os dados da coorte RNASeq de pacientes serão analisados ​​de forma abrangente para identificar aberrações de splicing recorrentes (espera-se que sejam principalmente saltos de exon) que ocorrem especificamente em tumores de cólon MSI em comparação com CRCs MSS e mucosa colônica normal correspondente. Entre eles, o estudo se concentrará nas aberrações de splicing devidas ao MSI e que afetam os éxons com um íntron flanqueador a montante contendo um LNCR ≥ 15 pb que está localizado ≤ 6 pb da junção íntron-exon (local aceitador de splice) (RNASeqMSI- pré-lista de exon). Como afirmado acima, cerca de 2.000 genes humanos contêm pelo menos um íntron com um LNCR muito próximo ao sítio aceitador de splicing AG na junção íntron-exon. Aproximadamente 100 genes humanos podem ser afetados por eventos de splicing aberrante recorrentes e específicos devido a MSI em CRC (principalmente salto de exon; deduzido de experimentos realizados em uma série limitada de linhagens celulares de CRC e tumores primários usando matrizes de exon; resultados preliminares e não publicados).

WP2 - Investigar links funcionais entre MSI e eventos de splicing aberrantes.

Após a análise do RNASeq, a confirmação dos eventos de splicing aberrante devido ao MSI será necessária usando outra abordagem metodológica para eliminar eventos falsos positivos. Isso será obtido com INCa quantitativo em tempo real - PRTK 2014 18/51 RT-PCR usando sondas internas específicas (Applied biosystems). Para cada exon ignorado na pré-lista de exons de RNASeqMSI, será projetado um par comum de primers direto e reverso localizados nos éxons flanqueadores.

Duas sondas internas serão projetadas, localizadas dentro dos éxons ignorados ou abrangendo os éxons flanqueadores em sua junção, a fim de detectar mRNA normal ou com splicing aberrante de maneira competitiva, respectivamente. É altamente sensível e também evita sinais falsos positivos devido à contaminação com DNA genômico. Exons candidatos que serão retidos são aqueles que exibem saltos aberrantes e recorrentes em linhagens de células MSI CRC e tumores primários em comparação com controles MSS CRC.

De acordo com nossa hipótese de trabalho, o estudo determinará se cada aberração de splicing confirmada é impulsionada por MSI. Isso será alcançado conforme descrito anteriormente para as deleções de T17 no íntron 8 de HSP110 que foram identificadas especificamente no MSI CRC e levam ao salto do exon 9. Resumidamente, os perfis alélicos de LNCR intrônico adjacente (ver acima) serão analisados ​​usando genotipagem baseada em fluorescência no painel de linhas celulares MSI e MSS CRC, bem como na série completa de tumores primários MSI da coorte de pacientes RNASeq e pares normais mucosa (a fim de avaliar o estado polimórfico). Isso será realizado usando o mesmo método desenvolvido anteriormente em nosso laboratório para análise da repetição do DNA HSP110 T17. Após a migração dos produtos de PCR em um Analisador Genético ABI 3100 com padrões de tamanho GS400HD ROX e polímero POP-7 (Applied Biosystems), o software GeneMapper V4.0 (Applied Biosystems) será usado para analisar traços LNCR, com aplicação de um AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism). Traços serão considerados aceitáveis ​​quando as amplitudes de pico estiverem entre 100 e 6.000 unidades de fluorescência. Um script MSI Perl foi desenvolvido para comparar automaticamente traços LNCR em amostras normais e tumorais, permitindo assim a detecção de picos LNCR aberrantes que ficam fora da zona polimórfica observada na população normal. Tal como acontece com o HSP110, espera-se (i) detectar deleções/inserções somáticas em alguns dos candidatos a LNCRs usando esta abordagem e (ii) identificar aqueles cujas alterações somáticas devido ao MSI estão significativamente associadas a eventos relacionados ao salto de exon no Nível de RNA (lista final de exon MSI).

WP3 - Identificar eventos de splicing e/ou mutações LNCR com relevância clínica em pacientes com MSI CRC. A relevância clínica dos genes candidatos (lista final de exons MSI) será avaliada usando modelos de regressão de sobrevivência multivariados para RFS (Relapse-Free Survival). O número de eventos de splicing candidatos e/ou mutações LNCR é de aproximadamente 100 (ver WP1 e WP2 acima) e INCa - PRTK 2014 19/51 outros determinantes clínicos conhecidos, como estágio, tratamento e idade no diagnóstico, serão considerados nos modelos multivariados. Os falsos positivos são uma das principais armadilhas na identificação de marcadores potencialmente relevantes entre dezenas de candidatos. Como o número (p) de covariáveis ​​a serem consideradas será da mesma ordem que o número de indivíduos, o "contexto de alta dimensão" será alcançado. Consequentemente, os algoritmos usuais para modelos de regressão de sobrevivência (por exemplo, coxph em R) falhará em estimar os parâmetros e identificar eventos com relevância clínica. Em nossa análise, três questões metodológicas principais requerem atenção especial, particularmente no nível algorítmico.

O WP3 será dividido em duas etapas principais, a primeira das quais diz respeito a comparações e ao desenvolvimento de algoritmos estatísticos. Uma vez ajustados, os algoritmos serão executados para identificar biomarcadores de prognóstico que envolvam eventos de splicing e/ou mutações LNCR com relevância clínica.

Modelos de regressão de alta dimensão e algoritmos de laço. Na primeira etapa serão consideradas apenas mutações de splicing e determinantes clínicos nos modelos de regressão de sobrevivência. Neste caso, a seleção de variáveis ​​e estimativa de parâmetros será conduzida com um algoritmo de laço (ou rede elástica) (ver Simon et al. para o modelo de Cox, e Gaiffas et al. para o modelo de Aalen, ambos implementados em R).

Em publicações anteriores, foi demonstrado que os valores dos pontos de corte resultaram em diferenças máximas de sobrevida entre grupos de pacientes com grandes ou pequenas deleções no HSP110 T17 LNCR e com alta ou baixa expressão do mRNA mutante do HSP110 devido ao salto do exon 9 no INCa - PRTK 2014 20/51 nível de mRNA. Uma vez que outros eventos de splicing podem apresentar o mesmo efeito de limite, os pontos de corte para até 100 eventos de splicing candidatos serão cuidadosamente determinados. Mesmo na estatística clássica, a determinação do ponto de corte é uma dificuldade conhecida por causa da superdetecção. Conforme proposto recentemente em um contexto relacionado, o "algoritmo de laço com pré-triagem" pode ser adaptado para incorporar a determinação do ponto de corte no algoritmo principal.

Outros pontos. Os dados ausentes serão tratados por múltiplas imputações de métodos de vizinho mais próximo ou de regressão. O estudo irá considerar possíveis interações com o uso de quimioterapia. Como etapa final, as estimativas serão executadas na coorte de treinamento (Saint-Antoine) para derivar um biomarcador prognóstico que incluirá eventos de splicing e/ou mutações LNCR com relevância clínica. Este biomarcador será validado na coorte de teste (multicêntrico). A análise de bootstrap será realizada para determinar o biomarcador.

WP4 - Iniciar estudos funcionais em um número limitado de genes clinicamente relevantes relacionados ao câncer cujo splicing é altamente perturbado em células cancerígenas MSI e desenvolver ferramentas biológicas para simplificar a triagem em futuros ensaios clínicos. Conforme declarado anteriormente, foi realizado um estudo preliminar usando matrizes de exon em uma pequena série de linhagens de células MSI CRC e tumores primários (não publicados). Isso foi conduzido para avaliar a viabilidade, tempo, custo, fatores adversos, tamanho do efeito (variabilidade estatística) e para melhorar o desenho do estudo antes de realizar o presente projeto de pesquisa em grande escala. As funções dos 100 genes candidatos detectados (alguns dos quais podem se sobrepor aos identificados na triagem de RNAseq) foram frequentemente relacionadas a processos relacionados ao câncer, como síntese macromolecular (30%), capacidade proliferativa celular ou morte celular (20%). resistência a drogas (10%) e outras (via WNT, processo metastático, alterações na estrutura cromossômica). O presente projeto espera identificar vários mutantes de splicing robustos conduzidos por MSI que são clinicamente relevantes (ver WP2 e WP3 acima). Esses mutantes podem ter funções oncogênicas ou antioncogênicas, uma vez que alguns (como HSP110) podem ser produzidos em níveis elevados, embora tenham impactos negativos na célula tumoral (consulte nossa hipótese funcional acima sobre a influência prejudicial esperada do MSI no LNCR em CRC). Neste contexto, estudos funcionais in vitro serão desenhados para caracterizar o impacto oncogênico de um pequeno número (n=5) de mutantes putativos clinicamente relevantes. Esses experimentos serão baseados em silenciamento transiente ou superexpressão usando siRNA ou plasmídeos e leitura biológica ad hoc em modelos celulares de CRC já disponíveis em nosso laboratório.

Dependendo dos resultados obtidos, outras investigações podem ser planejadas usando modelos de CRC transfectados de forma estável e xenoenxertados em camundongos nus. Além disso, o plano de estudo para validar ferramentas biológicas (por exemplo, Anticorpos) para otimizar a triagem futura de pacientes usando ensaios de rotina, semelhante ao nosso trabalho com HSP110 e o mutante HSP110DE9. Tissue Microarrays (TMAs) serão construídos a partir de blocos rotineiramente preparados, fixados em formalina e embebidos em parafina, coletados retrospectivamente do Departamento de Patologia do hospital Saint-Antoine. O tecido neoplásico será amostrado, incluindo a frente invasiva do tumor (3 a 6 amostras de núcleos de tecido de 0,6 mm de diâmetro). Quando disponível, a metástase linfonodal pareada também será amostrada. Imuno-histoquímica com anticorpos gerados especificamente (subcontratação) para reconhecer proteínas candidatas selvagens ou mutantes será realizada em TMAs. Os eventos de salto de exon são frameshift em 2/3 dos casos e, portanto, geram proteínas truncadas que possuem caudas C-terminais aberrantes e imunogênicas. Serão avaliadas as correlações entre a expressão de proteínas e as características clínico-patológicas, bem como seus valores prognósticos e preditivos. As imagens das lâminas de TMA serão capturadas como arquivos digitais de alta resolução e a avaliação de cada coloração será feita por dois patologistas.