Épissages aberrants dus à l'instabilité des microsatellites dans le cancer colorectal : impact physiopathologique et clinique

WP1 - Identifier les jonctions exon/intron spécifiquement affectées par les événements d'épissage aberrants dans le MSI CRC. Les séquences seront d'abord évaluées au CNG à l'aide du logiciel Pipeline CASAVA (Consensus Assessment of Sequence And Variation) d'Illumina. Ce programme convertit les scores d'intensité en appels de base, en alignements notés de qualité et en formats supplémentaires pour l'analyse en aval, transformant ainsi rapidement les données en informations biologiquement pertinentes. Les données filtrées seront ensuite transférées vers la plateforme du CIT (Carte d'Identité des Tumeurs ; http://cit.ligue-cancer.net, dir: A. de Reynies) à analyser par notre expert en bio-informatique. Le workflow Cufflinks sera utilisé pour quantifier les niveaux d'expression des transcrits dans les tumeurs MSI. Cela permet des mesures d'assemblage, de découverte et d'expression différentielle de la transcription à une résolution au niveau de la transcription. Étant donné que le flux de travail standard des boutons de manchette ne prend pas en charge la découverte ou la quantification de la fusion de gènes, plusieurs nouvelles fonctionnalités y seront intégrées. Premièrement, SoapFuse sera utilisé pour détecter les points de rupture de fusion et pour prédire les séquences de jonction de fusion. Ceux-ci seront intégrés dans le génome de référence humain et l'annotation des gènes du projet Gencode afin de fournir une annotation complète et intégrée des caractéristiques des gènes pour la cartographie des lectures d'épissage. Le processus d'intégration INCa - PRTK 2014 17/51 respectera plusieurs règles afin de minimiser le potentiel de perturbation de la quantification du niveau d'expression dans les analyses à venir. Avec l'aide de notre génome de référence personnalisé et de notre annotation, TopHat, un aligneur qui prend en charge la jonction d'épissage et la cartographie de fusion de gènes, sera utilisé pour la cartographie RNASeq. Les boutons de manchette seront ensuite utilisés pour trouver de nouvelles variantes d'épissage, y compris de nouvelles isoformes de saut d'exon.

Ceux-ci seront intégrés dans l'annotation à l'aide de Cuffmerge. En fonction des résultats d'alignement obtenus avec TopHat, plusieurs filtres seront appliqués pour éliminer les candidats de faible qualité pour la variation d'épissage et la fusion de gènes, ainsi que les candidats incompatibles avec les transcrits annotés existants. Si nécessaire, les lectures seront assemblées par AbySS puis alignées sur le génome de référence par BLAT pour fournir plus d'informations pour affiner l'annotation. Cela produira un assemblage de transcriptome contenant des événements de fusion de gènes et de saut d'exon à haute confiance. L'identification de ces événements sera ensuite effectuée dans des échantillons individuels. Cuffdiff sera utilisé pour analyser le résultat de la cartographie, également basé sur cet assemblage de transcriptome, pour appeler les gènes et transcrits exprimés de manière différentielle et pour détecter les changements d'épissage différentiel. Enfin, CummeRbund sera utilisé pour interpréter et visualiser les résultats.

La fiabilité de l'analyse RNA-seq sera vérifiée en recherchant les transcrits épissés de manière aberrante déjà signalés dans les cancers MSI (par ex. MRE11 et HSP110) et pour des mutations ponctuelles dans les séquences codantes des gènes cibles pour MSI (par exemple, TGFBR2, IGF2R, TCF7L2, AXIN2, PTEN, RIZ) et dans d'autres gènes liés au cancer qui servent de contrôles positifs internes (par exemple. KRAS, BRAF, TP53, PIK3CA). Il est à noter que ce projet fait partie de plusieurs autres développés conjointement avec le CIT-Ligue et qui visent à caractériser le MSI CRC à l'aide des technologies Omics. Fait important, ces données sont déjà disponibles pour un nombre important d'échantillons et pourraient donc être exploitées si nécessaire.

Les données de la cohorte de patients RNASeq seront analysées de manière approfondie pour identifier les aberrations d'épissage récurrentes (qui devraient être principalement des sauts d'exon) qui se produisent spécifiquement dans les tumeurs du côlon MSI par rapport aux CRC MSS et à la muqueuse colique normale correspondante. Parmi celles-ci, l'étude portera sur les aberrations d'épissage dues au MSI et affectant les exons avec un intron adjacent en amont contenant un LNCR ≥ 15 bp situé à ≤ 6 bp de la jonction intron-exon (site accepteur d'épissage) (RNASeqMSI- pré-liste des exons). Comme indiqué ci-dessus, environ 2 000 gènes humains contiennent au moins un intron avec un LNCR très proche du site accepteur d'épissage AG à la jonction intron-exon. Environ 100 gènes humains pourraient être affectés par des événements d'épissage aberrants récurrents et spécifiques dus au MSI dans le CCR (principalement le saut d'exon ; déduit d'expériences réalisées dans une série limitée de lignées cellulaires de CRC et de tumeurs primaires à l'aide de réseaux d'exons ; résultats préliminaires et non publiés).

WP2 - Rechercher des liens fonctionnels entre MSI et événements d'épissage aberrants.

Suite à l'analyse RNASeq, la confirmation des événements d'épissage aberrants dus au MSI sera requise en utilisant une autre approche méthodologique afin d'éliminer les événements faux positifs. Ceci sera réalisé grâce à la RT-PCR quantitative en temps réel utilisant des sondes spécifiques internes (Applied biosystems). Pour chaque exon ignoré dans la pré-liste des exons RNASeqMSI, une paire commune d'amorces directes et inverses situées dans les exons flanquants sera conçue.

Deux sondes internes seront conçues, situées soit dans les exons sautés, soit couvrant les exons flanquants à leur jonction afin de détecter l'ARNm normal ou épissé de manière aberrante de manière compétitive, respectivement. Il est très sensible et évite également les faux signaux positifs dus à la contamination par l'ADN génomique. Les exons candidats qui seront retenus sont ceux qui présentent des sauts aberrants et récurrents dans les lignées cellulaires MSI CRC et les tumeurs primaires par rapport aux témoins MSS CRC.

Conformément à notre hypothèse de travail, l'étude déterminera ensuite si chaque aberration d'épissage confirmée est induite par le MSI. Ceci sera réalisé comme décrit précédemment pour les délétions de T17 dans l'intron 8 de HSP110 qui ont été identifiées spécifiquement dans le MSI CRC et conduisent au saut de l'exon 9. En bref, les profils alléliques des LNCR introniques adjacents (voir ci-dessus) seront analysés à l'aide du génotypage par fluorescence dans le panel de lignées cellulaires MSI et MSS CRC, ainsi que dans la série complète de tumeurs primaires MSI de la cohorte de patients RNASeq et normaux appariés. muqueuse (afin d'évaluer le statut polymorphe). Cela sera effectué en utilisant la même méthode développée plus tôt dans notre laboratoire pour l'analyse de la répétition d'ADN HSP110 T17. Suite à la migration des produits de PCR sur un analyseur génétique ABI 3100 avec des étalons de taille GS400HD ROX et un polymère POP-7 (Applied Biosystems), le logiciel GeneMapper V4.0 (Applied Biosystems) sera utilisé pour analyser les traces LNCR, avec application d'un AFLP (Amplified Biosystems). Fragment Length Polymorphism). Les traces seront considérées comme acceptables lorsque les amplitudes maximales se situent entre 100 et 6 000 unités de fluorescence. Un script MSI Perl a été développé pour comparer automatiquement les traces LNCR dans les échantillons normaux et tumoraux, permettant ainsi la détection de pics LNCR aberrants qui se situent en dehors de la zone polymorphe observée dans la population normale. Comme avec HSP110, il est prévu (i) de détecter des suppressions/insertions somatiques dans certains des LNCR candidats utilisant cette approche, et (ii) d'identifier ceux dont les altérations somatiques dues au MSI sont significativement associées à des événements liés au saut d'exon au Niveau d'ARN (liste finale des exons MSI).

WP3 - Identifier les événements d'épissage et/ou les mutations LNCR ayant une pertinence clinique chez les patients atteints de CCR MSI. La pertinence clinique des gènes candidats (liste finale des exons MSI) sera évaluée à l'aide de modèles de régression de survie multivariés pour RFS (Relapse-Free Survival). Le nombre d'événements d'épissage candidats et/ou de mutations LNCR est d'environ 100 (voir WP1 et WP2 ci-dessus) et d'autres déterminants cliniques connus tels que le stade, le traitement et l'âge au diagnostic seront pris en compte dans les modèles multivariés. Les faux positifs sont l'un des principaux pièges dans l'identification de marqueurs potentiellement pertinents parmi des dizaines de candidats. Comme le nombre (p) de covariables à considérer sera du même ordre que le nombre d'individus, le « cadre de grande dimension » sera atteint. Par conséquent, les algorithmes habituels des modèles de régression de survie (par ex. coxph dans R) ne parviendra pas à estimer les paramètres et à identifier les événements ayant une pertinence clinique. Dans notre analyse, trois principales questions méthodologiques nécessitent une attention particulière, notamment au niveau algorithmique.

Le WP3 sera divisé en deux étapes principales dont la première concerne les comparaisons et le développement d'algorithmes statistiques. Une fois réglés, les algorithmes seront exécutés pour identifier un ou plusieurs biomarqueurs pronostiques impliquant des événements d'épissage et/ou des mutations LNCR ayant une pertinence clinique.

Modèles de régression de grande dimension et algorithmes de lasso. Dans la première étape, seuls les mutations d'épissage et les déterminants cliniques dans les modèles de régression de survie seront pris en compte. Dans ce cas, la sélection des variables et l'estimation des paramètres seront effectuées avec un algorithme de lasso (ou filet élastique) (voir Simon et al. pour le modèle de Cox, et Gaiffas et al. pour le modèle d'Aalen, tous deux implémentés dans R).

Dans des publications précédentes, il a été démontré que les valeurs seuils entraînaient des différences de survie maximales entre les groupes de patients présentant des délétions grandes ou petites dans le LNCR HSP110 T17, et avec une expression élevée ou faible de l'ARNm mutant HSP110 en raison du saut de l'exon 9 à l'INCa - PRTK 2014 20/51 niveau d'ARNm. Étant donné que d'autres événements d'épissage pourraient présenter le même effet de seuil, les points de coupure pour jusqu'à 100 événements d'épissage candidats seront soigneusement déterminés. Même dans les statistiques classiques, la détermination du point de coupure est une difficulté connue en raison de la surdétection. Comme récemment proposé dans un contexte connexe, le "lasso avec algorithme de présélection" pourrait être adapté pour incorporer la détermination du point de coupure dans l'algorithme principal.

Autres pointes. Les données manquantes seront traitées par des imputations multiples à partir de méthodes du plus proche voisin ou de régression. L'étude examinera les interactions possibles avec l'utilisation de la chimiothérapie. Dans une dernière étape, des estimations seront effectuées sur la cohorte de formation (Saint-Antoine) pour dériver un biomarqueur pronostique qui inclura les événements d'épissage et/ou les mutations LNCR avec une pertinence clinique. Ce biomarqueur sera validé sur la cohorte test (multicentrique). Une analyse bootstrap sera effectuée pour déterminer le biomarqueur.

WP4 - Initier des études fonctionnelles sur un nombre limité de gènes cliniquement pertinents liés au cancer dont l'épissage est fortement perturbé dans les cellules cancéreuses MSI, et développer des outils biologiques pour simplifier le dépistage dans les futurs essais cliniques. Comme indiqué précédemment, une étude préliminaire a été réalisée à l'aide de réseaux d'exons dans une petite série de lignées cellulaires MSI CRC et de tumeurs primaires (non publiées). Ceci a été mené pour évaluer la faisabilité, le temps, le coût, les facteurs défavorables, la taille de l'effet (variabilité statistique) et pour améliorer la conception de l'étude avant d'effectuer le présent projet de recherche à grande échelle. Les fonctions des 100 gènes candidats détectés (dont certains peuvent chevaucher ceux identifiés à partir du criblage RNAseq) étaient fréquemment liées à des processus liés au cancer tels que la synthèse macromoléculaire (30%), la capacité de prolifération cellulaire ou la mort cellulaire (20%), résistance aux médicaments (10%) et autres (voie WNT, processus métastatique, modifications de la structure chromosomique). Le présent projet prévoit d'identifier plusieurs mutants d'épissage robustes pilotés par MSI qui sont cliniquement pertinents (voir WP2 et WP3 ci-dessus). Ces mutants pourraient avoir des fonctions soit oncogènes, soit anti-cancéreuses, étant donné que certains (comme HSP110) peuvent être produits à des niveaux élevés même s'ils ont des impacts négatifs sur la cellule tumorale (voir notre hypothèse fonctionnelle ci-dessus concernant l'influence néfaste attendue du MSI au LNCR dans CRC). Dans ce contexte, des études fonctionnelles in vitro seront conçues pour caractériser l'impact oncogénique d'un petit nombre (n=5) de mutants putatifs cliniquement pertinents. Ces expériences seront basées sur le silençage transitoire ou la surexpression à l'aide de siARN ou de plasmides et la lecture biologique ad hoc dans des modèles cellulaires de CRC déjà disponibles dans notre laboratoire.

En fonction des résultats obtenus, d'autres investigations pourraient alors être planifiées en utilisant des modèles de CRC transfectés de manière stable xénogreffés dans des souris nude. De plus, le plan d'étude pour valider les outils biologiques (ex. Anticorps) pour optimiser le dépistage futur des patients en utilisant des tests de routine, similaires à nos travaux avec HSP110 et le mutant HSP110DE9. Des Tissue Microarrays (TMAs) seront construits à partir de blocs préparés en routine, fixés au formol et inclus en paraffine, collectés rétrospectivement auprès du Service d'Anatomie Pathologique de l'hôpital Saint-Antoine. Le tissu néoplasique sera prélevé, y compris le front invasif de la tumeur (3 à 6 échantillons de carottes tissulaires de 0,6 mm de diamètre). Lorsqu'elles sont disponibles, les métastases ganglionnaires appariées seront également échantillonnées. L'immunohistochimie avec des anticorps générés spécifiquement (sous-traitance) pour reconnaître des protéines candidates sauvages ou mutantes sera réalisée sur des TMA. Les événements de saut d'exon sont des décalages de cadre dans 2/3 des cas et génèrent ainsi des protéines tronquées qui ont des queues C-terminales immunogènes et aberrantes. Les corrélations entre l'expression des protéines et les caractéristiques clinico-pathologiques seront évaluées, ainsi que leurs valeurs pronostiques et prédictives. Les images de diapositives TMA seront capturées sous forme de fichiers numériques haute résolution et l'évaluation de chaque coloration sera effectuée par deux pathologistes.