Giunzioni aberranti dovute all'instabilità dei microsatelliti nel cancro colorettale: impatto fisiopatologico e clinico

WP1 - Identificare le giunzioni esone/introne che sono specificamente interessate da eventi di splicing aberranti in MSI CRC. Le sequenze saranno prima valutate al CNG utilizzando il software Pipeline CASAVA (Consensus Assessment of Sequence And Variation) di Illumina. Questo programma converte i punteggi di intensità in identificazioni delle basi, allineamenti con punteggio di qualità e formati aggiuntivi per l'analisi a valle, trasformando così rapidamente i dati in informazioni biologicamente rilevanti. I dati filtrati verranno quindi trasferiti alla piattaforma CIT (Carte d'Identité des Tumeurs; http://cit.ligue-cancer.net, dir: A. de Reynies) per essere analizzato dal nostro esperto di bioinformatica. Il flusso di lavoro dei gemelli verrà utilizzato per quantificare i livelli di espressione del trascritto nei tumori MSI. Ciò consente misure di assemblaggio di trascrizioni, scoperta e espressione differenziale a risoluzione a livello di trascrizione. Poiché il flusso di lavoro standard di Gemelli non supporta la scoperta o la quantificazione della fusione genica, verranno incorporate diverse nuove funzionalità. In primo luogo, SoapFuse verrà utilizzato per rilevare i punti di rottura della fusione e per prevedere le sequenze di giunzione di fusione. Questi saranno integrati nel genoma di riferimento umano e nell'annotazione genica del progetto Gencode per fornire un'annotazione completa e integrata delle caratteristiche geniche per la mappatura delle letture di splicing. Il processo di integrazione INCa - PRTK 2014 17/51 rispetterà diverse regole per ridurre al minimo il potenziale di disturbare la quantificazione del livello di espressione nelle prossime analisi. Con l'aiuto del nostro genoma di riferimento personalizzato e annotazione, TopHat, un allineatore che supporta la mappatura della giunzione di giunzione e della fusione genica verrà utilizzato per la mappatura RNASeq. I gemelli verranno quindi utilizzati per trovare nuove varianti di giunzione, comprese nuove isoforme di salto dell'esone.

Questi verranno integrati nell'annotazione utilizzando Cuffmerge. A seconda dei risultati di allineamento ottenuti con TopHat, verranno applicati diversi filtri per rimuovere i candidati di bassa qualità per la variazione di splicing e la fusione genica, nonché i candidati che sono incompatibili con le trascrizioni annotate esistenti. Ove necessario, le letture saranno assemblate da AbySS e quindi allineate sul genoma di riferimento da BLAT per fornire ulteriori informazioni per perfezionare l'annotazione. Ciò produrrà un assemblaggio del trascrittoma contenente eventi di fusione genica ad alta confidenza ed eventi di salto dell'esone. L'identificazione di questi eventi sarà quindi eseguita in singoli campioni. Cuffdiff sarà utilizzato per analizzare il risultato della mappatura, anch'esso basato su questo assemblaggio del trascrittoma, per chiamare geni e trascritti differenzialmente espressi e per rilevare cambiamenti di splicing differenziali. Infine, CummeRbund sarà utilizzato per interpretare e visualizzare i risultati.

L'affidabilità dell'analisi RNA-seq sarà verificata ricercando trascritti con splicing aberrante già riportati nei tumori MSI (es. MRE11 e HSP110) e per mutazioni puntiformi nelle sequenze codificanti di geni bersaglio per MSI (es. KRAS, BRAF, TP53, PIK3CA). Vale la pena notare che questo progetto fa parte di molti altri sviluppati in collaborazione con CIT-Ligue e che mirano a caratterizzare MSI CRC utilizzando le tecnologie Omics. È importante sottolineare che questi dati sono già disponibili per un numero significativo di campioni e potrebbero quindi essere sfruttati se necessario.

I dati della coorte di pazienti RNASeq saranno analizzati in modo completo per identificare le aberrazioni di splicing ricorrenti (che dovrebbero essere principalmente exon skipping) che si verificano specificamente nei tumori del colon MSI rispetto ai CRC MSS e corrispondenti alla normale mucosa del colon. Tra questi, lo studio si concentrerà sulle aberrazioni di splicing dovute a MSI e che interessano esoni con un introne a monte fiancheggiante contenente un LNCR ≥ 15 bp che si trova a ≤ 6 bp dalla giunzione introne-esone (sito accettore di giunzione) (RNASeqMSI- esone pre-lista). Come affermato sopra, circa 2.000 geni umani contengono almeno un introne con un LNCR molto vicino al sito dell'accettore di splicing AG alla giunzione introne-esone. Circa 100 geni umani potrebbero essere influenzati da eventi di splicing aberranti ricorrenti e specifici dovuti a MSI in CRC (principalmente exon skipping; dedotto da esperimenti eseguiti in una serie limitata di linee cellulari CRC e tumori primari utilizzando array di esoni; risultati preliminari e non pubblicati).

WP2 - Indagare collegamenti funzionali tra MSI ed eventi di splicing aberranti.

Dopo l'analisi RNASeq, sarà richiesta la conferma degli eventi di splicing aberranti dovuti a MSI utilizzando un altro approccio metodologico al fine di eliminare gli eventi falsi positivi. Ciò sarà ottenuto con RT-PCR quantitativa INCa - PRTK 2014 18/51 in tempo reale utilizzando sonde specifiche interne (Applied biosystems). Per ogni esone saltato nella pre-lista RNASeqMSI-exon, sarà progettata una coppia comune di primer forward e reverse localizzati negli esoni fiancheggianti.

Saranno progettate due sonde interne, posizionate all'interno degli esoni saltati o che attraversano gli esoni fiancheggianti alla loro giunzione per rilevare rispettivamente mRNA normale o splicing aberrante in modo competitivo. È altamente sensibile ed evita anche i falsi segnali positivi dovuti alla contaminazione con il DNA genomico. Gli esoni candidati che verranno mantenuti sono quelli che mostrano salti aberranti e ricorrenti nelle linee cellulari MSI CRC e nei tumori primari rispetto ai controlli MSS CRC.

In linea con la nostra ipotesi di lavoro, lo studio determinerà quindi se ogni aberrazione di splicing confermata è guidata da MSI. Ciò sarà ottenuto come descritto in precedenza per le delezioni T17 nell'introne 8 di HSP110 che sono state identificate specificamente in MSI CRC e portano allo skipping dell'esone 9. In breve, i profili allelici dell'LNCR intronico adiacente (vedi sopra) saranno analizzati utilizzando la genotipizzazione basata sulla fluorescenza nel pannello di linee cellulari MSI e MSS CRC, nonché nella serie completa di tumori primari MSI dalla coorte di pazienti RNASeq e normale accoppiato mucosa (per valutare lo stato polimorfico). Questo verrà eseguito utilizzando lo stesso metodo sviluppato in precedenza nel nostro laboratorio per l'analisi della ripetizione del DNA HSP110 T17. Dopo la migrazione dei prodotti PCR su un analizzatore genetico ABI 3100 con standard di dimensioni ROX GS400HD e polimero POP-7 (Applied Biosystems), il software GeneMapper V4.0 (Applied Biosystems) verrà utilizzato per analizzare le tracce LNCR, con l'applicazione di un AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism). Le tracce saranno considerate accettabili quando le ampiezze dei picchi sono comprese tra 100 e 6.000 unità di fluorescenza. È stato sviluppato uno script MSI Perl per confrontare automaticamente le tracce LNCR in campioni normali e tumorali, consentendo così il rilevamento di picchi LNCR aberranti che cadono al di fuori della zona polimorfica osservata nella popolazione normale. Come con HSP110, ci si aspetta (i) di rilevare delezioni/inserzioni somatiche in alcuni dei LNCR candidati utilizzando questo approccio e (ii) di identificare quelli le cui alterazioni somatiche dovute a MSI sono significativamente associate a eventi correlati allo skipping dell'esone a livello Livello di RNA (lista finale dell'esone MSI).

WP3 - Identificare eventi di splicing e/o mutazioni LNCR con rilevanza clinica in pazienti affetti da MSI CRC. La rilevanza clinica dei geni candidati (elenco finale degli esoni MSI) sarà valutata utilizzando modelli di regressione di sopravvivenza multivariata per RFS (Relapse-Free Survival). Il numero di eventi di splicing candidati e/o mutazioni LNCR è di circa 100 (vedere WP1 e WP2 sopra) e INCa - PRTK 2014 19/51 altri determinanti clinici noti come stadio, trattamento ed età alla diagnosi saranno considerati nei modelli multivariati. I falsi positivi sono una delle principali insidie ​​nell'identificare marcatori potenzialmente rilevanti tra dozzine di candidati. Poiché il numero (p) di covariate da considerare sarà dello stesso ordine del numero di individui, si raggiungerà il "setting ad alta dimensione". Di conseguenza, i soliti algoritmi per i modelli di regressione di sopravvivenza (ad es. coxph in R) non riuscirà a stimare i parametri e ad identificare gli eventi con rilevanza clinica. Nella nostra analisi, tre questioni metodologiche principali richiedono un'attenzione speciale, in particolare a livello algoritmico.

Il WP3 sarà suddiviso in due fasi principali, la prima delle quali riguarda i confronti e lo sviluppo di algoritmi statistici. Una volta sintonizzati, gli algoritmi verranno eseguiti per identificare uno o più biomarcatori prognostici che coinvolgono eventi di splicing e/o mutazioni LNCR con rilevanza clinica.

Modelli di regressione ad alta dimensione e algoritmi lazo. Nella prima fase verranno prese in considerazione solo mutazioni di splicing e determinanti clinici nei modelli di regressione di sopravvivenza. In questo caso, la selezione delle variabili e la stima dei parametri saranno condotte con un algoritmo lazo (o rete elastica) (vedi Simon et al. per il modello di Cox, e Gaiffas et al. per il modello di Aalen, entrambi implementati in R).

In pubblicazioni precedenti è stato dimostrato che i valori cut-point determinavano differenze massime di sopravvivenza tra gruppi di pazienti con delezioni grandi o piccole nell'LNCR HSP110 T17 e con espressione alta o bassa dell'mRNA mutante HSP110 a causa del salto dell'esone 9 all'INCa - PRTK 2014 20/51 livello di mRNA. Poiché altri eventi di giunzione potrebbero presentare lo stesso effetto soglia, i punti di taglio per un massimo di 100 eventi di giunzione candidati saranno attentamente determinati. Anche nella statistica classica, la determinazione del cut-point è una difficoltà nota a causa del rilevamento eccessivo. Come recentemente proposto in un contesto correlato, il "lazo con algoritmo di pre-screening" potrebbe essere adattato per incorporare la determinazione del punto di taglio nell'algoritmo principale.

Altri punti. I dati mancanti saranno gestiti da imputazioni multiple da metodi del vicino più vicino o di regressione. Lo studio prenderà in considerazione le possibili interazioni con l'uso della chemioterapia. Come passo finale, saranno eseguite stime sulla coorte di training (Saint-Antoine) per derivare un biomarcatore prognostico che includerà eventi di splicing e/o mutazioni LNCR con rilevanza clinica. Questo biomarcatore sarà convalidato sulla coorte del test (multicentrico). Verrà condotta un'analisi bootstrap per accertare il biomarcatore.

WP4 - Avviare studi funzionali su un numero limitato di geni correlati al cancro clinicamente rilevanti, il cui splicing è altamente perturbato nelle cellule tumorali MSI, e sviluppare strumenti biologici per semplificare lo screening in futuri test clinici. Come affermato in precedenza, è stato eseguito uno studio preliminare utilizzando array di esoni in una piccola serie di linee cellulari MSI CRC e tumori primari (non pubblicato). Questo è stato condotto per valutare la fattibilità, il tempo, il costo, i fattori avversi, la dimensione dell'effetto (variabilità statistica) e per migliorare il disegno dello studio prima di eseguire il presente progetto di ricerca su larga scala. Le funzioni dei 100 geni candidati rilevati (alcuni dei quali possono sovrapporsi a quelli identificati dallo screening RNAseq) erano spesso correlate a processi correlati al cancro come la sintesi macromolecolare (30%), la capacità proliferativa cellulare o la morte cellulare (20%), resistenza ai farmaci (10%) e altri (via WNT, processo metastatico, cambiamenti nella struttura cromosomica). Il presente progetto prevede di identificare diversi robusti mutanti di splicing guidati da MSI che siano clinicamente rilevanti (vedi sopra WP2 e WP3). Questi mutanti potrebbero avere funzioni oncogeniche o antioncogeniche, dato che alcuni (come HSP110) possono essere prodotti ad alti livelli anche se hanno impatti negativi sulla cellula tumorale (vedi la nostra ipotesi funzionale sopra riguardante l'influenza dannosa attesa di MSI a LNCR in CRC). In questo contesto, saranno progettati studi funzionali in vitro per caratterizzare l'impatto oncogenico di un piccolo numero (n=5) di putativi mutanti clinicamente rilevanti. Questi esperimenti saranno basati sul silenziamento transitorio o sulla sovraespressione usando siRNA o plasmidi e letture biologiche ad hoc in modelli cellulari di CRC già disponibili nel nostro laboratorio.

A seconda dei risultati ottenuti, potrebbero essere pianificate ulteriori indagini utilizzando modelli di CRC trasfettati stabilmente xenotrapiantati in topi nudi. Inoltre, il piano di studio per validare strumenti biologici (es. Anticorpi) per ottimizzare lo screening futuro dei pazienti utilizzando test di routine, simili al nostro lavoro con HSP110 e il mutante HSP110DE9. I microarray tissutali (TMA) saranno costruiti da blocchi preparati di routine, fissati in formalina e inclusi in paraffina raccolti retrospettivamente dal Dipartimento di Patologia dell'ospedale Saint-Antoine. Verrà campionato il tessuto neoplastico, compreso il fronte invasivo del tumore (da 3 a 6 campioni di carote di tessuto di 0,6 mm di diametro). Quando disponibili, verranno campionate anche le metastasi linfonodali accoppiate. L'immunoistochimica con anticorpi generati specificamente (subappalto) per riconoscere proteine ​​candidate wild-type o mutanti sarà eseguita su TMA. Gli eventi di salto dell'esone sono frameshift in 2/3 dei casi e quindi generano proteine ​​​​troncate che hanno code C-terminali immunogeniche e aberranti. Verranno valutate le correlazioni tra espressione proteica e caratteristiche clinico-patologiche, nonché i loro valori prognostici e predittivi. Le immagini dei vetrini TMA verranno acquisite come file digitali ad alta risoluzione e la valutazione di ciascuna colorazione verrà eseguita da due patologi.