Avvikande splitsningar på grund av mikrosatellitinstabilitet i kolorektal cancer: fysiopatologisk och klinisk påverkan

WP1 - För att identifiera exon/intron-övergångar som är specifikt påverkade av avvikande splitsningshändelser i MSI CRC. Sekvenser kommer först att utvärderas vid CNG med hjälp av Illuminas programvara Pipeline CASAVA (Consensus Assessment of Sequence And Variation). Detta program omvandlar intensitetspoäng till basanrop, kvalitetspoängjusteringar och ytterligare format för nedströmsanalys, och omvandlar på så sätt snabbt data till biologiskt relevant information. Den filtrerade informationen kommer sedan att överföras till CIT-plattformen (Carte d'Identité des Tumeurs; http://cit.ligue-cancer.net, dir: A. de Reynies) som ska analyseras av vår bioinformatikexpert. Manschettknapparnas arbetsflöde kommer att användas för att kvantifiera transkriptionsuttrycksnivåer i MSI-tumörer. Detta möjliggör transkriptionssammansättning, upptäckt och differentiella uttrycksmått på transkriptionsnivåupplösning. Eftersom standardarbetsflödet för Cufflinks inte stöder upptäckt eller kvantifiering av genfusion, kommer flera nya funktioner att införlivas i det. För det första kommer SoapFuse att användas för att detektera fusionsbrytpunkter och för att förutsäga fusionsövergångssekvenser. Dessa kommer att integreras i det mänskliga referensgenomet och genanteckningen från Gencode-projektet för att tillhandahålla en omfattande, integrerad annotering av genfunktioner för kartläggning av splitsningsläsningar. Integreringsprocessen INCa - PRTK 2014 17/51 kommer att följa flera regler för att minimera risken för att störa kvantifieringen av uttrycksnivån i kommande analyser. Med hjälp av vårt skräddarsydda referensgenom och annotering kommer TopHat, en aligner som stöder splice junction och genfusionskartläggning att användas för RNASeq-kartläggning. Manschettknappar kommer sedan att användas för att hitta nya skarvvarianter, inklusive nya exon-hoppande isoformer.

Dessa kommer att integreras i annoteringen med Cuffmerge. Beroende på anpassningsresultaten som erhållits med TopHat kommer flera filter att tillämpas för att ta bort lågkvalitativa kandidater för splitsningsvariation och genfusion, såväl som kandidater som är inkompatibla med befintliga annoterade transkript. Vid behov kommer läsningar att sammanställas av AbySS och sedan anpassas till referensgenomet av BLAT för att ge mer information för att förfina annoteringen. Detta kommer att producera en transkriptomsammansättning som innehåller högsäkerhetsgenfusion och exonhoppningshändelser. Identifiering av dessa händelser kommer sedan att utföras i individuella prover. Cuffdiff kommer att användas för att analysera kartläggningsresultatet, även baserat på denna transkriptomsammansättning, för att anropa differentiellt uttryckta gener och transkript och för att detektera differentiella splitsningsförändringar. Slutligen kommer CummeRbund att användas för att tolka och visualisera resultaten.

Tillförlitligheten av RNA-seq-analys kommer att verifieras genom att söka efter avvikande splitsade transkript som redan rapporterats i MSI-cancer (t.ex. MRE11 och HSP110) och för punktmutationer i de kodande sekvenserna av målgener för MSI (t.ex. TGFBR2, IGF2R, TCF7L2, AXIN2, PTEN, RIZ) och i andra cancerrelaterade gener som fungerar som interna positiva kontroller (t.ex. KRAS, BRAF, TP53, PIK3CA). Det är värt att notera att detta projekt är en del av flera andra som utvecklats tillsammans med CIT-Ligue och som syftar till att karakterisera MSI CRC med hjälp av Omics-teknologier. Viktigt är att dessa data redan finns tillgängliga för ett betydande antal prover och kan därför utnyttjas vid behov.

Data från RNASeq-kohorten av patienter kommer att analyseras omfattande för att identifiera återkommande splitsningsavvikelser (förväntas mestadels vara exon-hoppning) som förekommer specifikt i MSI-kolontumörer jämfört med MSS CRC och matchande normal kolonslemhinna. Bland dessa kommer studien att fokusera på splitsningsaberrationer som beror på MSI och som påverkar exoner med en flankerande uppströms intron som innehåller en ≥ 15 bp LNCR som är belägen ≤ 6 bp från intron-exon-övergången (skarvacceptorställe) (RNASeqMSI- exon pre-list). Som nämnts ovan innehåller cirka 2 000 humana gener åtminstone en intron med en LNCR mycket nära AG-splitsningsacceptorstället vid intron-exonövergången. Ungefär 100 mänskliga gener kan påverkas av återkommande och specifika avvikande splitsningshändelser på grund av MSI i CRC (mestadels exonhoppning; härledd från experiment utförda i en begränsad serie av CRC-cellinjer och primära tumörer med hjälp av exonmatriser; preliminära och opublicerade resultat).

WP2 - Att undersöka funktionella länkar mellan MSI och avvikande splitsningshändelser.

Efter RNASeq-analysen kommer bekräftelse av de avvikande splitsningshändelserna på grund av MSI att krävas med en annan metodologisk metod för att eliminera falskt positiva händelser. Detta kommer att uppnås med realtids kvantitativ INCa - PRTK 2014 18/51 RT-PCR med interna, specifika prober (Applied biosystems). För varje överhoppad exon i RNASeqMSI-exonförlistan kommer ett gemensamt par framåt- och bakåtprimrar som finns i de flankerande exonerna att utformas.

Två interna prober kommer att utformas, placerade antingen inom de överhoppade exonerna eller som sträcker sig över de flankerande exonerna vid deras korsning för att detektera normalt eller avvikande splitsat mRNA på ett kompetitivt sätt. Den är mycket känslig och undviker även falska positiva signaler på grund av kontaminering med genomiskt DNA. Kandidatexoner som kommer att behållas är de som visar avvikande och återkommande överhoppning i MSI CRC-cellinjer och primära tumörer jämfört med MSS CRC-kontroller.

I linje med vår arbetshypotes kommer studien sedan att avgöra om varje bekräftad skarvningsaberration är MSI-driven. Detta kommer att uppnås som beskrivits tidigare för T17-deletioner i intron 8 av HSP110 som identifierades specifikt i MSI CRC och leder till exon 9-hoppning. Kortfattat kommer allelprofiler av intilliggande intronisk LNCR (se ovan) att analyseras med fluorescensbaserad genotypning i panelen av MSI- och MSS CRC-cellinjer, såväl som i den kompletta serien av MSI primära tumörer från RNASeq-patientkohorten och parade normala slemhinna (för att bedöma polymorf status). Detta kommer att utföras med samma metod som utvecklats tidigare i vårt laboratorium för analys av HSP110 T17 DNA-upprepningen. Efter migrering av PCR-produkter på en ABI 3100 Genetic Analyzer med GS400HD ROX-storleksstandarder och POP-7-polymer (Applied Biosystems), kommer GeneMapper V4.0-programvara (Applied Biosystems) att användas för att analysera LNCR-spår, med tillämpning av en AFLP (Amplified) Fragment Length Polymorphism) metod. Spår kommer att anses vara acceptabla när toppamplituderna är mellan 100 och 6 000 fluorescensenheter. Ett MSI Perl-skript har utvecklats för att automatiskt jämföra LNCR-spår i normala prover och tumörprover, vilket möjliggör detektering av avvikande LNCR-toppar som faller utanför den polymorfa zonen som observeras i den normala populationen. Liksom med HSP110 förväntas det (i) att upptäcka somatiska deletioner/insertioner i några av de LNCR-kandidater med detta tillvägagångssätt, och (ii) att identifiera de vars somatiska förändringar på grund av MSI är signifikant associerade med exon-hoppningsrelaterade händelser vid RNA-nivå (MSI exon slutlig lista).

WP3 - För att identifiera splitsningshändelser och/eller LNCR-mutationer med klinisk relevans hos MSI CRC-patienter. Den kliniska relevansen av kandidatgener (MSI exon final list) kommer att bedömas med hjälp av multivariata överlevnadsregressionsmodeller för RFS (Relapse-Free Survival). Antalet kandidatskarvningshändelser och/eller LNCR-mutationer är cirka 100 (se WP1 och WP2 ovan) och INCa - PRTK 2014 19/51 andra kända kliniska determinanter såsom stadium, behandling och ålder vid diagnos kommer att beaktas i de multivariata modellerna. Falska positiva är en av de stora fallgroparna när det gäller att identifiera potentiellt relevanta markörer bland dussintals kandidater. Eftersom antalet (p) av kovariater som ska beaktas kommer att vara av samma storleksordning som antalet individer, kommer den "högdimensionella inställningen" att nås. Följaktligen kan de vanliga algoritmerna för överlevnadsregressionsmodeller (t.ex. coxph i R) kommer att misslyckas med att uppskatta parametrarna och att identifiera händelser med klinisk relevans. I vår analys kräver tre huvudsakliga metodfrågor särskild uppmärksamhet, särskilt på algoritmisk nivå.

WP3 kommer att delas upp i två huvudsteg, varav det första gäller jämförelser och utveckling av statistiska algoritmer. När de väl är inställda kommer algoritmerna att köras för att identifiera en eller flera prognostiska biomarkörer som involverar splitsningshändelser och/eller LNCR-mutationer med klinisk relevans.

Högdimensionella regressionsmodeller och lassoalgoritmer. I det första steget kommer endast splitsningsmutationer och kliniska determinanter i överlevnadsregressionsmodellerna att beaktas. I detta fall kommer variabelval och parameteruppskattning att utföras med en lasso (eller elastisk nät) algoritm (se Simon et al. för Cox-modellen och Gaiffas et al. för Aalen-modellen, båda implementerade i R).

I tidigare publikationer har det visat sig att cut-point-värden resulterade i maximala överlevnadsskillnader mellan patientgrupper med stora eller små deletioner i HSP110 T17 LNCR och med högt eller lågt uttryck av mutant HSP110 mRNA på grund av att exon 9 hoppar över vid INCa - PRTK 2014 20/51 mRNA-nivå. Eftersom andra splitsningshändelser kan uppträda med samma tröskeleffekt, kommer cut-points för upp till 100 kandidatskarvningshändelser att bestämmas noggrant. Även i klassisk statistik är bestämning av cut-point en känd svårighet på grund av överdetektering. Som nyligen föreslagits i ett relaterat sammanhang, skulle "lasso med förscreeningsalgoritm" kunna anpassas för att införliva skärpunktsbestämningen i huvudalgoritmen.

Andra punkter. Saknade data kommer att hanteras av flera imputationer från närmaste granne eller regressionsmetoder. Studien kommer att överväga möjliga interaktioner med användning av kemoterapi. Som ett sista steg kommer uppskattningar att köras på träningskohorten (Saint-Antoine) för att härleda en prognostisk biomarkör som kommer att inkludera splitsningshändelser och/eller LNCR-mutationer med klinisk relevans. Denna biomarkör kommer att valideras på testkohorten (multicenter). Bootstrap-analys kommer att utföras för att fastställa biomarkören.

WP4 - Att initiera funktionella studier på ett begränsat antal kliniskt relevanta, cancerrelaterade gener vars splitsning är mycket störd i MSI-cancerceller, och att utveckla biologiska verktyg för att förenkla screening i framtida kliniska analyser. Som nämnts tidigare har en preliminär studie utförts med hjälp av exonmatriser i en liten serie av MSI CRC-cellinjer och primära tumörer (opublicerade). Detta utfördes för att utvärdera genomförbarhet, tid, kostnad, negativa faktorer, effektstorlek (statistisk variabilitet) och för att förbättra studiedesignen innan det nuvarande fullskaliga forskningsprojektet genomförs. Funktionerna hos de 100 detekterade kandidatgener (av vilka en del kan överlappa de som identifierats från RNAseq-screening) var ofta relaterade till cancerrelaterade processer som makromolekylär syntes (30%), cellproliferativ förmåga eller celldöd (20%), läkemedelsresistens (10%) och andra (WNT-väg, metastatisk process, förändringar i kromosomstruktur). Det aktuella projektet förväntar sig att identifiera flera robusta MSI-drivna splitsmutanter som är kliniskt relevanta (se WP2 och WP3 ovan). Dessa mutanter kan ha antingen onkogena eller antionkogena funktioner, givet att vissa (som HSP110) kan produceras i höga nivåer även om de har negativa effekter på tumörcellen (se vår funktionshypotes ovan angående den förväntade skadliga inverkan av MSI vid LNCR i CRC). I detta sammanhang kommer in vitro funktionella studier att utformas för att karakterisera den onkogena effekten av ett litet antal (n=5) förmodade kliniskt relevanta mutanter. Dessa experiment kommer att baseras på övergående tystnad eller överuttryck med siRNA eller plasmider och ad hoc biologisk avläsning i CRC-cellmodeller som redan finns tillgängliga i vårt laboratorium.

Beroende på de erhållna resultaten kan ytterligare undersökningar sedan planeras med hjälp av stabilt transfekterade CRC-modeller xenotransplanterade i nakna möss. Dessutom har studieplanen för att validera biologiska verktyg (t.ex. Antikroppar) för att optimera den framtida screeningen av patienter med hjälp av rutinanalyser, liknande vårt arbete med HSP110 och HSP110DE9-mutanten. Tissue Microarrays (TMAs) kommer att konstrueras av rutinmässigt preparerade, formalinfixerade och paraffininbäddade block insamlade INCa - PRTK 2014 21/51 retrospektivt från patologiavdelningen på Saint-Antoine-sjukhuset. Neoplastisk vävnad kommer att tas, inklusive den tumörinvasiva fronten (3 till 6 prover av 0,6 mm diameter vävnadskärnor). När det är tillgängligt kommer även provtagning från parad lymfkörtelmetastas. Immunhistokemi med antikroppar som genererats specifikt (underleverantörer) för att känna igen vildtyps- eller mutantkandidatproteiner kommer att utföras på TMA. Exon-hoppningshändelser är ramskifte i 2/3 av fallen och genererar således trunkerade proteiner som har immunogena, avvikande C-terminala svansar. Korrelationer mellan proteinuttryck och klinisk-patologiska egenskaper kommer att utvärderas, såväl som deras prognostiska och prediktiva värden. TMA diabilder kommer att fångas som högupplösta digitala filer och utvärdering av varje färgning kommer att göras av två patologer.