Empalmes aberrantes por inestabilidad de microsatélites en cáncer colorrectal: impacto fisiopatológico y clínico

WP1: para identificar uniones de exón/intrón que se ven afectadas específicamente por eventos de empalme aberrante en MSI CRC. Las secuencias se evaluarán primero en CNG utilizando el software Pipeline CASAVA (Consensus Assessment of Sequence And Variation) de Illumina. Este programa convierte puntuaciones de intensidad en llamadas base, alineaciones de puntuación de calidad y formatos adicionales para el análisis posterior, transformando así rápidamente los datos en información biológicamente relevante. Los datos filtrados se transferirán a la plataforma CIT (Carte d'Identité des Tumeurs; http://cit.ligue-cancer.net, dir: A. de Reynies) para ser analizados por nuestro experto en bioinformática. El flujo de trabajo de Cufflinks se utilizará para cuantificar los niveles de expresión de transcritos en tumores MSI. Esto permite el ensamblaje de transcripciones, el descubrimiento y las medidas de expresión diferencial con resolución a nivel de transcripción. Debido a que el flujo de trabajo estándar de Cufflinks no admite el descubrimiento o la cuantificación de la fusión de genes, se le incorporarán varias funciones nuevas. En primer lugar, se utilizará SoapFuse para detectar puntos de ruptura de fusión y predecir secuencias de unión de fusión. Estos se integrarán en el genoma de referencia humano y la anotación de genes del proyecto Gencode para proporcionar una anotación completa e integrada de las características de los genes para el mapeo de lecturas de empalme. El proceso de integración INCa - PRTK 2014 17/51 cumplirá con varias reglas para minimizar el potencial de perturbar la cuantificación del nivel de expresión en los próximos análisis. Con la ayuda de nuestra anotación y genoma de referencia personalizados, TopHat, un alineador que admite el mapeo de unión de empalme y fusión de genes, se utilizará para el mapeo de RNASeq. Los gemelos luego se utilizarán para encontrar nuevas variantes de empalme, incluidas nuevas isoformas de omisión de exón.

Estos se integrarán en la anotación usando Cuffmerge. Dependiendo de los resultados de alineación obtenidos con TopHat, se aplicarán varios filtros para eliminar candidatos de baja calidad para variación de empalme y fusión de genes, así como candidatos que son incompatibles con las transcripciones anotadas existentes. Cuando sea necesario, AbySS ensamblará las lecturas y luego BLAT las alineará con el genoma de referencia para proporcionar más información para refinar la anotación. Esto producirá un ensamblaje de transcriptoma que contiene eventos de fusión de genes y omisión de exón de alta confianza. La identificación de estos eventos se realizará luego en muestras individuales. Cuffdiff se utilizará para analizar el resultado del mapeo, también basado en este ensamblaje de transcriptoma, para llamar a genes y transcripciones expresados ​​​​diferencialmente y para detectar cambios de empalme diferencial. Finalmente, se utilizará CummeRbund para interpretar y visualizar los resultados.

La confiabilidad del análisis de RNA-seq se verificará mediante la búsqueda de transcritos empalmados aberrantes ya informados en cánceres MSI (p. MRE11 y HSP110) y para mutaciones puntuales en las secuencias de codificación de genes diana para MSI (por ejemplo, TGFBR2, IGF2R, TCF7L2, AXIN2, PTEN, RIZ) y en otros genes relacionados con el cáncer que sirven como controles positivos internos (por ejemplo. KRAS, BRAF, TP53, PIK3CA). Vale la pena señalar que este proyecto es parte de varios otros desarrollados en conjunto con CIT-Ligue y que tienen como objetivo caracterizar MSI CRC utilizando tecnologías Omics. Es importante destacar que estos datos ya están disponibles para un número significativo de muestras y, por lo tanto, podrían explotarse si fuera necesario.

Los datos de la cohorte de pacientes de RNASeq se analizarán exhaustivamente para identificar aberraciones de corte y empalme recurrentes (que se espera que sean en su mayoría omisión de exón) que ocurren específicamente en tumores de colon MSI en comparación con MSS CRC y la mucosa colónica normal coincidente. Entre estos, el estudio se centrará en las aberraciones de empalme que se deben a MSI y que afectan a los exones con un intrón ascendente flanqueante que contiene un LNCR de ≥ 15 pb que se encuentra a ≤ 6 pb de la unión intrón-exón (sitio aceptor de empalme) (RNASeqMSI- pre-lista de exones). Como se indicó anteriormente, alrededor de 2000 genes humanos contienen al menos un intrón con un LNCR muy cercano al sitio aceptor de corte y empalme AG en la unión intrón-exón. Aproximadamente 100 genes humanos podrían verse afectados por eventos de corte y empalme aberrantes específicos y recurrentes debido a MSI en CRC (principalmente omisión de exón; deducido de experimentos realizados en una serie limitada de líneas celulares de CRC y tumores primarios usando matrices de exón; resultados preliminares y no publicados).

WP2: para investigar vínculos funcionales entre MSI y eventos de empalme aberrantes.

Después del análisis de RNASeq, se requerirá la confirmación de los eventos de empalme aberrante debido a MSI utilizando otro enfoque metodológico para eliminar los eventos falsos positivos. Esto se logrará con INCa - PRTK 2014 18/51 RT-PCR cuantitativo en tiempo real usando sondas específicas internas (Applied biosystems). Para cada exón omitido en la lista previa de exones de RNASeqMSI, se diseñará un par común de cebadores directos e inversos ubicados en los exones laterales.

Se diseñarán dos sondas internas, ubicadas dentro de los exones omitidos o abarcando los exones flanqueantes en su unión para detectar ARNm normal o aberrantemente empalmado de manera competitiva, respectivamente. Es altamente sensible y además evita señales de falso positivo por contaminación con ADN genómico. Los exones candidatos que se conservarán son aquellos que muestran saltos aberrantes y recurrentes en líneas celulares MSI CRC y tumores primarios en comparación con los controles MSS CRC.

De acuerdo con nuestra hipótesis de trabajo, el estudio determinará si cada aberración de empalme confirmada está impulsada por MSI. Esto se logrará como se describió anteriormente para las eliminaciones de T17 en el intrón 8 de HSP110 que se identificaron específicamente en MSI CRC y conducen a la omisión del exón 9. Brevemente, los perfiles alélicos de LNCR intrónicos adyacentes (ver arriba) se analizarán usando genotipado basado en fluorescencia en el panel de líneas celulares MSI y MSS CRC, así como en la serie completa de tumores primarios MSI de la cohorte de pacientes RNASeq y pares normales. mucosa (para evaluar el estado polimórfico). Esto se realizará utilizando el mismo método desarrollado anteriormente en nuestro laboratorio para el análisis de la repetición de ADN HSP110 T17. Después de la migración de los productos de PCR en un analizador genético ABI 3100 con estándares de tamaño GS400HD ROX y polímero POP-7 (Applied Biosystems), se utilizará el software GeneMapper V4.0 (Applied Biosystems) para analizar las trazas de LNCR, con la aplicación de un AFLP (Amplified Biosystems). Polimorfismo de longitud de fragmentos). Las trazas se considerarán aceptables cuando las amplitudes máximas estén entre 100 y 6000 unidades de fluorescencia. Se ha desarrollado un script MSI Perl para comparar automáticamente los rastros de LNCR en muestras normales y tumorales, lo que permite la detección de picos de LNCR anómalos que quedan fuera de la zona polimórfica observada en la población normal. Al igual que con HSP110, se espera (i) detectar deleciones/inserciones somáticas en algunos de los LNCR candidatos utilizando este enfoque, y (ii) identificar aquellos cuyas alteraciones somáticas debido a MSI están significativamente asociadas con eventos relacionados con la omisión de exón en el Nivel de ARN (lista final de exones de MSI).

WP3 - Identificar eventos de splicing y/o mutaciones de LNCR con relevancia clínica en pacientes con MSI CRC. La relevancia clínica de los genes candidatos (lista final de exones de MSI) se evaluará mediante modelos de regresión de supervivencia multivariable para RFS (supervivencia libre de recaídas). El número de eventos de splicing candidatos y/o mutaciones de LNCR es de aproximadamente 100 (ver WP1 y WP2 arriba) e INCa - PRTK 2014 19/51 otros determinantes clínicos conocidos, como el estadio, el tratamiento y la edad en el momento del diagnóstico, se considerarán en los modelos multivariados. Los falsos positivos son una de las principales dificultades para identificar marcadores potencialmente relevantes entre docenas de candidatos. Como el número (p) de covariables a considerar será del mismo orden que el número de individuos, se alcanzará el "ajuste de alta dimensión". En consecuencia, los algoritmos habituales para los modelos de regresión de supervivencia (p. coxph en R) no podrá estimar los parámetros ni identificar eventos con relevancia clínica. En nuestro análisis, tres cuestiones metodológicas principales requieren atención especial, particularmente a nivel algorítmico.

El WP3 se dividirá en dos pasos principales, el primero de los cuales se refiere a las comparaciones y al desarrollo de algoritmos estadísticos. Una vez ajustados, los algoritmos se ejecutarán para identificar biomarcadores pronósticos que involucren eventos de empalme y/o mutaciones LNCR con relevancia clínica.

Modelos de regresión de alta dimensión y algoritmos de lazo. En el primer paso, solo se considerarán las mutaciones de empalme y los determinantes clínicos en los modelos de regresión de supervivencia. En este caso, la selección de variables y la estimación de parámetros se realizarán con un algoritmo de lazo (o red elástica) (ver Simon et al. para el modelo de Cox, y Gaiffas et al. para el modelo de Aalen, ambos implementados en R).

En publicaciones anteriores, se demostró que los valores de punto de corte dieron como resultado diferencias máximas de supervivencia entre grupos de pacientes con deleciones grandes o pequeñas en HSP110 T17 LNCR, y con expresión alta o baja de ARNm de HSP110 mutante debido a la omisión del exón 9 en INCa - PRTK 2014 20/51 nivel de ARNm. Dado que otros eventos de empalme podrían presentarse con el mismo efecto de umbral, los puntos de corte para hasta 100 eventos de empalme candidatos se determinarán cuidadosamente. Incluso en la estadística clásica, la determinación del punto de corte es una dificultad conocida debido a la sobredetección. Como se propuso recientemente en un contexto relacionado, el "algoritmo de lazo con preselección" podría adaptarse para incorporar la determinación del punto de corte en el algoritmo principal.

Otros puntos. Los datos faltantes se manejarán mediante múltiples imputaciones de los métodos de regresión o del vecino más cercano. El estudio considerará posibles interacciones con el uso de quimioterapia. Como paso final, se realizarán estimaciones en la cohorte de entrenamiento (Saint-Antoine) para derivar un biomarcador de pronóstico que incluirá eventos de empalme y/o mutaciones de LNCR con relevancia clínica. Este biomarcador será validado en la cohorte de prueba (multicéntrico). Se realizará un análisis Bootstrap para determinar el biomarcador.

WP4: iniciar estudios funcionales en un número limitado de genes clínicamente relevantes relacionados con el cáncer cuyo empalme está muy perturbado en las células cancerosas MSI, y desarrollar herramientas biológicas para simplificar la detección en futuros ensayos clínicos. Como se indicó anteriormente, se realizó un estudio preliminar utilizando matrices de exón en una pequeña serie de líneas celulares MSI CRC y tumores primarios (no publicado). Esto se llevó a cabo para evaluar la viabilidad, el tiempo, el costo, los factores adversos, el tamaño del efecto (variabilidad estadística) y mejorar el diseño del estudio antes de realizar el presente proyecto de investigación a gran escala. Las funciones de los 100 genes candidatos detectados (algunos de los cuales pueden superponerse con los identificados a partir de la detección de RNAseq) se relacionaron con frecuencia con procesos relacionados con el cáncer, como la síntesis macromolecular (30 %), la capacidad de proliferación celular o la muerte celular (20 %). farmacorresistencia (10%) y otros (vía WNT, proceso metastásico, cambios en la estructura cromosómica). El presente proyecto espera identificar varios mutantes de empalme robustos impulsados ​​por MSI que sean clínicamente relevantes (ver WP2 y WP3 arriba). Estos mutantes podrían tener funciones oncogénicas o antioncogénicas, dado que algunos (como HSP110) pueden producirse en niveles altos aunque tengan un impacto negativo en la célula tumoral (consulte nuestra hipótesis funcional anterior sobre la influencia perjudicial esperada de MSI en LNCR en CDN). En este contexto, se diseñarán estudios funcionales in vitro para caracterizar el impacto oncogénico de un pequeño número (n=5) de supuestos mutantes clínicamente relevantes. Estos experimentos se basarán en el silenciamiento transitorio o la sobreexpresión utilizando siRNA o plásmidos y lecturas biológicas ad hoc en modelos celulares CRC ya disponibles en nuestro laboratorio.

Dependiendo de los resultados obtenidos, podrían planificarse más investigaciones utilizando modelos de CRC transfectados de forma estable xenoinjertados en ratones desnudos. Además, el plan de estudio para validar herramientas biológicas (p. Anticuerpos) para optimizar la detección futura de pacientes mediante ensayos de rutina, similar a nuestro trabajo con HSP110 y el mutante HSP110DE9. Los microarreglos de tejido (TMA) se construirán a partir de bloques incluidos en parafina, fijados en formalina y preparados de forma rutinaria recogidos retrospectivamente del Departamento de Patología del hospital de Saint-Antoine. Se tomarán muestras de tejido neoplásico, incluido el frente invasivo del tumor (3 a 6 muestras de núcleos de tejido de 0,6 mm de diámetro). Cuando esté disponible, también se tomarán muestras de metástasis de ganglios linfáticos emparejados. La inmunohistoquímica con anticuerpos generados específicamente (subcontratación) para reconocer proteínas candidatas de tipo salvaje o mutantes se realizará en TMA. Los eventos de omisión de exón se desplazan del marco de lectura en 2/3 de los casos y, por lo tanto, generan proteínas truncadas que tienen colas C-terminales aberrantes inmunogénicas. Se evaluarán las correlaciones entre la expresión de proteínas y las características clínico-patológicas, así como sus valores pronósticos y predictivos. Las imágenes de los portaobjetos de TMA se capturarán como archivos digitales de alta resolución y dos patólogos realizarán la evaluación de cada tinción.