A kolorektális rák mikroszatellita instabilitása miatti aberráns splicingek: Fiziopatológiai és klinikai hatás

WP1 – Azon exon/intron csomópontok azonosítása, amelyeket kifejezetten érintenek az aberráns illesztési események az MSI CRC-ben. A szekvenciákat először CNG-ben értékelik ki az Illumina Pipeline CASAVA (Consensus Assessment of Sequence And Variation) szoftverével. Ez a program az intenzitási pontszámokat alaphívásokká, minőségi pontozásokká és további formátumokká alakítja át a downstream elemzéshez, így gyorsan átalakítja az adatokat biológiailag releváns információvá. A szűrt adatok ezután átkerülnek a CIT platformra (Carte d'Identité des Tumeurs; http://cit.ligue-cancer.net, rendező: A. de Reynies) bioinformatikai szakértőnk elemzi. A mandzsettagombok munkafolyamatát az MSI-daganatok transzkripciós expressziós szintjének számszerűsítésére fogják használni. Ez lehetővé teszi az átirat-összeállítást, a felfedezést és a differenciális kifejezési méréseket átirat szintű felbontás mellett. Mivel a szabványos mandzsettagombok munkafolyamata nem támogatja a génfúzió felfedezését vagy mennyiségi meghatározását, számos új funkciót építenek be. Először is, a SoapFuse-t a fúziós töréspontok kimutatására és a fúziós csomópontok szekvenciáinak előrejelzésére fogják használni. Ezeket beépítik a Gencode projekt emberi referenciagenomjába és génannotációjába, hogy átfogó, integrált annotációt biztosítsanak a génjellemzőkről a splicing leolvasások feltérképezéséhez. Az INCa - PRTK 2014 17/51 integrációs folyamat számos szabályt betart, hogy minimálisra csökkentse az expressziós szint számszerűsítésének megzavarásának lehetőségét a következő elemzésekben. Testre szabott referencia genomunk és annotációnk, a TopHat segítségével egy olyan aligner, amely támogatja a splice junction és a génfúziós térképezést, az RNASeq térképezéshez kerül felhasználásra. A mandzsettagombokat ezután új splice variánsok megtalálására fogják használni, beleértve az új exonokat kihagyó izoformákat.

Ezeket a Cuffmerge segítségével integráljuk a kommentárba. A TopHat segítségével elért illesztési eredményektől függően számos szűrőt alkalmaznak a splice variáció és a génfúzió gyenge minőségű jelöltjei, valamint a meglévő, annotált átiratokkal nem kompatibilis jelöltek eltávolítására. Ahol szükséges, az AbySS összeállítja a leolvasásokat, majd a BLAT hozzáigazítja a referenciagenomhoz, hogy további információkat biztosítson az annotáció finomításához. Ez egy olyan transzkriptom-összeállítást eredményez, amely nagy megbízhatóságú génfúziót és exonátugrási eseményeket tartalmaz. Ezeket az eseményeket azután egyedi mintákban azonosítják. Cuffdiff segítségével elemezzük a leképezési eredményt, szintén ezen a transzkriptom-összeállításon alapulva, a differenciálisan expresszált gének és átiratok meghívására, valamint a differenciális splicing változások kimutatására. Végül a CummeRbundot használjuk az eredmények értelmezésére és megjelenítésére.

Az RNS-seq analízis megbízhatóságát az MSI rákos megbetegedések esetében már jelentett aberránsan összeillesztett transzkriptumok keresésével ellenőrizzük (pl. MRE11 és HSP110), valamint az MSI célgének (pl. TGFBR2, IGF2R, TCF7L2, AXIN2, PTEN, RIZ) kódoló szekvenciáinak pontmutációira, valamint más rákkal kapcsolatos génekre, amelyek belső pozitív kontrollként szolgálnak (pl. KRAS, BRAF, TP53, PIK3CA). Érdemes megjegyezni, hogy ez a projekt része több olyan projektnek, amelyet a CIT-Ligue-val közösen fejlesztettek ki, és amelyek az MSI CRC jellemzését célozzák Omics technológiák segítségével. Fontos, hogy ezek az adatok már jelentős számú mintánál rendelkezésre állnak, ezért szükség esetén hasznosíthatók.

A betegek RNASeq kohorszának adatait átfogóan elemzik annak érdekében, hogy azonosítsák a visszatérő splicing aberrációkat (várhatóan exonkihagyás), amelyek kifejezetten MSI vastagbéldaganatokban fordulnak elő, összehasonlítva az MSS CRC-kkel és a megfelelő vastagbélnyálkahártyával. Ezek közül a tanulmány az MSI-ből eredő splicing aberrációkra összpontosít, amelyek olyan exonokat érintenek, amelyek egy ≥ 15 bp méretű LNCR-t tartalmaznak, és amely ≤ 6 bp távolságra található az intron-exon csomóponttól (splice acceptor hely) (RNASeqMSI- exon előlista). Mint fentebb említettük, körülbelül 2000 humán gén tartalmaz legalább egy intront, amelynek LNCR-je nagyon közel van az AG splice akceptor helyéhez az intron-exon csomópontnál. Körülbelül 100 humán gént érinthet az ismétlődő és specifikus aberráns splicing események az MSI miatt CRC-ben (főleg exon kihagyás; CRC sejtvonalak és primer tumorok korlátozott sorozatában, exontömbök segítségével végzett kísérletekből következtetve; előzetes és nem publikált eredmények).

WP2 - Az MSI és az aberráns splicing események közötti funkcionális kapcsolatok vizsgálata.

Az RNASeq analízist követően a hamis pozitív események kiküszöbölése érdekében más módszertani megközelítéssel meg kell erősíteni az MSI miatti aberráns splicing eseményeket. Ezt a valós idejű kvantitatív INCa - PRTK 2014 18/51 RT-PCR segítségével érik el belső, specifikus szondák (Alkalmazott biorendszerek) segítségével. Az RNASeqMSI-exon-előlistában szereplő minden egyes kihagyott exonhoz egy közös előre és fordított primerpárt terveznek, amelyek a szomszédos exonokban találhatók.

Két belső szondát tervezünk, amelyek vagy az átugrott exonokon belül helyezkednek el, vagy a szomszédos exonokon átívelnek azok találkozásánál, hogy a normál vagy rendellenesen összeillesztett mRNS-t kompetitív módon detektálják. Nagyon érzékeny, és elkerüli a genomi DNS-sel való szennyeződés miatti hamis pozitív jeleket. Azok a jelölt exonok, amelyek megmaradnak, azok, amelyek aberráns és visszatérő kihagyást mutatnak az MSI CRC sejtvonalakban és primer tumorokban az MSS CRC kontrollokhoz képest.

Munkahipotézisünkkel összhangban a tanulmány ezután meghatározza, hogy minden egyes megerősített illesztési aberráció MSI-vezérelt-e. Ezt a korábban leírtak szerint érjük el a HSP110 8. intronjában lévő T17 delécióknál, amelyeket specifikusan az MSI CRC-ben azonosítottak, és a 9. exon kihagyásához vezettek. Röviden, a szomszédos intronikus LNCR allélprofiljait (lásd fent) fluoreszcencia alapú genotipizálással elemzik az MSI és MSS CRC sejtvonalak paneljén, valamint az RNASeq betegcsoportból származó és párosított normál MSI primer tumorok teljes sorozatában. nyálkahártya (a polimorf állapot felmérése érdekében). Ezt ugyanazzal a módszerrel hajtjuk végre, amelyet korábban laboratóriumunkban a HSP110 T17 DNS-ismétlődés elemzésére fejlesztettünk ki. A PCR termékek GS400HD ROX méretszabványokkal és POP-7 polimerrel (Applied Biosystems) rendelkező ABI 3100 Genetic Analyzerre történő migrációját követően a GeneMapper V4.0 szoftvert (Applied Biosystems) használják az LNCR nyomok elemzésére, AFLP (Amplified) alkalmazásával. Fragment Length Polymorphism) módszer. A nyomok akkor tekinthetők elfogadhatónak, ha a csúcsamplitúdó 100 és 6000 fluoreszcencia egység között van. Egy MSI Perl-szkriptet fejlesztettek ki, amely automatikusan összehasonlítja az LNCR-nyomokat normál és tumormintákban, így lehetővé teszi a rendellenes LNCR-csúcsok kimutatását, amelyek kívül esnek a normál populációban megfigyelt polimorf zónán. A HSP110-hez hasonlóan várhatóan (i) észlelni kell a szomatikus deléciókat/inszerciókat néhány jelölt LNCR-ben ezzel a megközelítéssel, és (ii) azonosítani kell azokat, amelyeknek az MSI miatti szomatikus elváltozásai szignifikánsan összefüggenek az exonátugrással kapcsolatos eseményekkel. RNS szint (MSI exon végső lista).

WP3 - Klinikai jelentőségű splicing események és/vagy LNCR mutációk azonosítása MSI CRC-s betegekben. A jelölt gének klinikai jelentőségét (MSI exon végső lista) az RFS (Relapse-Free Survival) többváltozós túlélési regressziós modelljei segítségével értékelik. A jelölt splicing események és/vagy LNCR-mutációk száma hozzávetőleg 100 (lásd fentebb a WP1-et és a WP2-t), és a többváltozós modellekben egyéb ismert klinikai determinánsokat, például a stádiumot, a kezelést és a diagnózis felállításának korát is figyelembe veszik. A hamis pozitív eredmények jelentik az egyik fő buktatót a potenciálisan releváns markerek azonosításában több tucat jelölt között. Mivel a figyelembe veendő kovariánsok száma (p) azonos nagyságrendű lesz az egyedek számával, a „nagydimenziós beállítás” el fog érni. Következésképpen a túlélési regressziós modelleknél szokásos algoritmusok (pl. coxph az R)-ben nem tudja megbecsülni a paramétereket és nem azonosítani a klinikai jelentőségű eseményeket. Elemzésünkben három fő módszertani kérdés igényel különös figyelmet, különösen algoritmikus szinten.

A WP3 két fő lépésre oszlik, amelyek közül az első az összehasonlításokra és a statisztikai algoritmusok fejlesztésére vonatkozik. A hangolást követően az algoritmusokat lefuttatják egy prognosztikai biomarker(ek) azonosítására, amelyek klinikai jelentőségű splicing eseményeket és/vagy LNCR mutációkat tartalmaznak.

Nagydimenziós regressziós modellek és lasszó-algoritmusok. Az első lépésben csak a splicing mutációkat és a klinikai determinánsokat veszik figyelembe a túlélési regressziós modellekben. Ebben az esetben a változók kiválasztását és a paraméterbecslést lasszó (vagy rugalmas háló) algoritmussal hajtják végre (lásd Simon és munkatársai a Cox-modellhez, illetve Gaiffas és munkatársai az Aalen-modellhez, mindkettő R-ben implementálva).

Korábbi publikációkban kimutatták, hogy a cut-point értékek maximális túlélési különbséget eredményeztek a HSP110 T17 LNCR-ben nagy vagy kis deléciókkal, valamint a mutáns HSP110 mRNS magas vagy alacsony expressziójával a 9-es exon kihagyása miatt az INCa - PRTK-nál. 2014 20/51 mRNS szint. Mivel más illesztési események is megjelenhetnek ugyanazzal a küszöbhatással, a vágási pontokat legfeljebb 100 jelölt illesztési eseményhez gondosan meg kell határozni. A vágási pont meghatározása még a klasszikus statisztikában is ismert nehézség a túldetektálás miatt. Amint azt a közelmúltban javasolták egy kapcsolódó összefüggésben, a "lasszó előzetes szűrési algoritmussal" adaptálható a vágási pont meghatározásának a fő algoritmusba történő beépítésére.

Egyéb pontok. A hiányzó adatokat a rendszer a legközelebbi szomszédból származó többszörös imputációval vagy regressziós módszerrel kezeli. A tanulmány figyelembe veszi a kemoterápia alkalmazásával való lehetséges kölcsönhatásokat. Utolsó lépésként becsléseket hajtanak végre a képzési csoporton (Saint-Antoine), hogy olyan prognosztikai biomarkert kapjanak, amely magában foglalja a klinikai jelentőségű splicing eseményeket és/vagy LNCR mutációkat. Ezt a biomarkert a teszt kohorszban (többközpontú) validálják. Bootstrap elemzést végeznek a biomarker meghatározására.

WP4 – Funkcionális vizsgálatok kezdeményezése korlátozott számú klinikailag releváns, rákkal kapcsolatos génen, amelyek splicingje erősen zavart az MSI rákos sejtekben, és biológiai eszközök kifejlesztése a jövőbeli klinikai vizsgálatok egyszerűsítésére. Amint azt korábban említettük, egy előzetes vizsgálatot végeztek exontömbök felhasználásával MSI CRC sejtvonalak és primer tumorok kis sorozatában (nem publikált). Ezt a megvalósíthatóság, az idő, a költségek, a kedvezőtlen tényezők, a hatás méretének (statisztikai variabilitás) értékelése és a tanulmányterv javítása érdekében végezték el a jelen teljes körű kutatási projekt végrehajtása előtt. A 100 kimutatott jelölt gén funkciója (amelyek némelyike ​​átfedésben lehet az RNAseq-szűrés során azonosítottakkal) gyakran olyan rákkal kapcsolatos folyamatokhoz kapcsolódott, mint a makromolekuláris szintézis (30%), a sejtproliferációs képesség vagy a sejthalál (20%), gyógyszerrezisztencia (10%) és mások (WNT út, metasztatikus folyamat, kromoszómaszerkezet változásai). A jelen projekt több robusztus, MSI-vezérelt splice mutánst kíván azonosítani, amelyek klinikailag relevánsak (lásd fentebb a WP2 és WP3). Ezeknek a mutánsoknak akár onkogén, akár antionkogén funkciója lehet, tekintettel arra, hogy egyesek (például a HSP110) magas szinten képződhetnek, még akkor is, ha negatív hatással vannak a tumorsejtre (lásd a fenti funkcionális hipotézisünket az MSI várható káros hatásáról az LNCR-re CRC). Ebben az összefüggésben in vitro funkcionális vizsgálatokat terveznek, hogy jellemezzék kisszámú (n=5) feltételezett klinikailag releváns mutáns onkogén hatását. Ezek a kísérletek tranziens elnémításon vagy túlzott expresszión alapulnak siRNS-t vagy plazmidokat, valamint ad hoc biológiai leolvasást a laboratóriumunkban már elérhető CRC sejtmodellekben.

A kapott eredményektől függően további vizsgálatok tervezhetők stabilan transzfektált, csupasz egerekbe xenografált CRC modellekkel. Ezenkívül a vizsgálati terv a biológiai eszközök validálására (pl. Antitestek), hogy optimalizáljuk a betegek jövőbeni szűrését rutin vizsgálatok segítségével, hasonlóan a HSP110 és a HSP110DE9 mutánssal végzett munkánkhoz. A szöveti mikrotömböket (TMA-k) a Saint-Antoine Kórház Patológiai Osztályáról visszamenőleg gyűjtött, rutinszerűen előkészített, formalinnal rögzített és paraffinba ágyazott blokkokból állítják elő. Neoplasztikus szövetből mintát vesznek, beleértve a tumor invazív frontját (3-6 minta 0,6 mm átmérőjű szövetmagból). Ha rendelkezésre áll, a páros nyirokcsomó-metasztázisokból is mintát vesznek. A vad típusú vagy mutáns fehérjejelöltek felismerésére specifikusan (alvállalkozásban) előállított antitestekkel immunhisztokémiát végeznek TMA-kon. Az exonátugrási események az esetek 2/3-ában kereteltolódást okoznak, és így csonkolt fehérjéket hoznak létre, amelyek immunogén, rendellenes C-terminális farokkal rendelkeznek. A fehérje expressziója és a klinikai-patológiai jellemzők közötti összefüggéseket, valamint ezek prognosztikai és prediktív értékeit értékeljük. A TMA diaképeket nagy felbontású digitális fájlként rögzítik, és az egyes festések értékelését két patológus végzi.