結腸直腸癌におけるマイクロサテライト不安定性による異常なスプライシング：生理病理学的および臨床的影響

WP1 - MSI CRC の異常なスプライシング イベントによって特に影響を受けるエクソン/イントロン ジャンクションを特定します。 シーケンスは、最初にイルミナの Pipeline CASAVA (Consensus Assessment of Sequence And Variation) ソフトウェアを使用して CNG で評価されます。 このプログラムは、強度スコアをベース コール、クオリティ スコア付きアラインメント、およびダウンストリーム分析用の追加フォーマットに変換し、データを生物学的に関連する情報に迅速に変換します。 フィルタリングされたデータは、CIT プラットフォーム (Carte d'Identité des Tumeurs; http://cit.ligue-cancer.net、 dir: A. de Reynies) をバイオインフォマティクスの専門家が分析します。 Cufflinks ワークフローは、MSI 腫瘍の転写発現レベルを定量化するために使用されます。 これにより、転写物レベルの解像度での転写物のアセンブリ、発見、および差次的発現測定が可能になります。 標準の Cufflinks ワークフローは遺伝子融合の発見や定量化をサポートしていないため、いくつかの新しい機能が組み込まれます。 まず、SoapFuse を使用して、融合ブレーク ポイントを検出し、融合ジャンクション シーケンスを予測します。 これらは、Gencode プロジェクトのヒト参照ゲノムおよび遺伝子アノテーションに統合され、スプライシング リードのマッピングのための遺伝子機能の包括的で統合されたアノテーションを提供します。 統合 INCa - PRTK 2014 17/51 プロセスは、今後の分析で発現レベルの定量化を妨げる可能性を最小限に抑えるために、いくつかの規則に従います。 カスタマイズされたリファレンス ゲノムとアノテーションの助けを借りて、スプライス ジャンクションと遺伝子融合マッピングをサポートするアライナーである TopHat が RNASeq マッピングに使用されます。 次に、カフスボタンを使用して、新しいエクソン スキッピング アイソフォームを含む新しいスプライス バリアントを見つけます。

これらは、Cuffmerge を使用して注釈に統合されます。 TopHat で得られたアラインメント結果に応じて、いくつかのフィルターが適用され、スプライス バリエーションや遺伝子融合の低品質候補、および既存の注釈付き転写産物と互換性のない候補が除外されます。 必要に応じて、リードは AbySS によってアセンブルされ、BLAT によって参照ゲノムにアラインされ、アノテーションを改良するための詳細情報が提供されます。 これにより、信頼性の高い遺伝子融合とエクソン スキッピング イベントを含むトランスクリプトーム アセンブリが生成されます。 これらのイベントの識別は、個々 のサンプルで実行されます。 Cuffdiff は、このトランスクリプトーム アセンブリに基づいてマッピング結果を分析し、差次的に発現する遺伝子と転写産物を呼び出し、差次的スプライシングの変化を検出するために使用されます。 最後に、CummeRbund を使用して結果を解釈および視覚化します。

RNA-seq 解析の信頼性は、MSI がんですでに報告されている異常にスプライシングされた転写産物を検索することによって検証されます (例: MRE11 および HSP110) および MSI の標的遺伝子のコード配列 (例: TGFBR2、IGF2R、TCF7L2、AXIN2、PTEN、RIZ) および内部陽性対照として機能する他のがん関連遺伝子 (例: KRAS、BRAF、TP53、PIK3CA)。 このプロジェクトは、CIT-Ligue と共同で開発された他のいくつかのプロジェクトの一部であり、Omics テクノロジを使用して MSI CRC の特性を評価することを目的としていることは注目に値します。 重要なことに、このデータはすでにかなりの数のサンプルで利用可能であるため、必要に応じて活用できます。

患者の RNASeq コホートからのデータを包括的に分析して、MSS CRC と比較して MSI 結腸腫瘍で特異的に発生し、正常な結腸粘膜と一致する再発性スプライシング異常 (主にエクソン スキッピングであると予想される) を特定します。 これらの中で、この研究は、MSI によるスプライシング異常に焦点を当て、イントロン - エクソン接合部 (スプライスアクセプター部位) から ≤ 6 bp に位置する ≥ 15 bp LNCR を含む隣接する上流イントロンを持つエクソンに影響を与えます (RNASeqMSI-エクソンプレリスト）。 前述のように、約 2,000 のヒト遺伝子には、イントロンとエクソンの接合部にある AG スプライス受容部位に非常に近い LNCR を持つ少なくとも 1 つのイントロンが含まれています。 約 100 のヒト遺伝子が、CRC の MSI による再発性および特異的な異常なスプライシング イベントの影響を受ける可能性があります (ほとんどがエクソン スキッピングです。限られた一連の CRC 細胞株および原発腫瘍でエクソン アレイを使用して実施された実験から推定されます。予備的および未発表の結果)。

WP2 - MSI と異常なスプライシング イベントの間の機能的なリンクを調査します。

RNASeq 分析に続いて、MSI による異常なスプライシング イベントの確認は、偽陽性イベントを排除するために別の方法論的アプローチを使用して必要になります。 これは、内部の特異的プローブを使用したリアルタイムの定量的 INCa - PRTK 2014 18/51 RT-PCR (Applied biosystems) で達成されます。 RNASeqMSI-exon pre-list のスキップされたエクソンごとに、隣接するエクソンにあるフォワード プライマーとリバース プライマーの共通のペアが設計されます。

2 つの内部プローブが設計され、スキップされたエクソン内に配置されるか、接合部で隣接するエクソンにまたがって配置され、それぞれ競合的に正常または異常にスプライシングされた mRNA を検出します。 感度が高く、ゲノム DNA の混入による偽陽性シグナルを回避します。 保持される候補エクソンは、MSS CRC コントロールと比較して、MSI CRC 細胞株および原発腫瘍で異常および再発性スキッピングを示すエクソンです。

私たちの作業仮説に沿って、この研究では、確認された各スプライシング異常がMSI駆動型であるかどうかを判断します. これは、MSI CRC で特異的に特定され、エクソン 9 スキッピングにつながる HSP110 のイントロン 8 の T17 欠失について前述したように達成されます。 簡単に説明すると、隣接するイントロン LNCR (上記参照) の対立遺伝子プロファイルは、MSI および MSS CRC 細胞株のパネル、ならびに RNASeq 患者コホートおよび対になった正常からの MSI 原発腫瘍の完全なシリーズにおいて、蛍光ベースのジェノタイピングを使用して分析されます。粘膜（多形状態を評価するため）。 これは、HSP110 T17 DNA リピートの分析のために私たちの研究室で以前に開発された同じ方法を使用して実行されます。 GS400HD ROX サイズ標準および POP-7 ポリマー (Applied Biosystems) を使用した ABI 3100 Genetic Analyzer での PCR 産物の移行後、GeneMapper V4.0 ソフトウェア (Applied Biosystems) を使用して、AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) メソッド。 ピーク振幅が 100 ～ 6,000 蛍光単位の場合、トレースは許容可能と見なされます。 MSI Perl スクリプトは、正常サンプルと腫瘍サンプルの LNCR トレースを自動的に比較するように開発されているため、正常集団で観察される多型ゾーンの外側にある異常な LNCR ピークを検出できます。 HSP110 と同様に、(i) このアプローチを使用して候補 LNCR の一部で体細胞の欠失/挿入を検出すること、および (ii) MSI による体細胞の変化がエクソンスキッピング関連イベントと有意​​に関連している LNCR を特定することが期待されます。 RNA レベル (MSI エクソン最終リスト)。

WP3 - MSI CRC 患者において臨床的に関連するスプライシング イベントおよび/または LNCR 変異を特定すること。 候補遺伝子 (MSI エクソン最終リスト) の臨床的関連性は、RFS (無再発生存) の多変量生存回帰モデルを使用して評価されます。 候補となるスプライシング イベントおよび/または LNCR 変異の数は約 100 であり (上記の WP1 および WP2 を参照)、INCa - PRTK 2014 19/51 の他の既知の臨床的決定要因 (病期、治療、診断時年齢など) が多変量モデルで考慮されます。 偽陽性は、数十の候補の中から潜在的に関連するマーカーを特定する際の主要な落とし穴の 1 つです。 考慮される共変量の数 (p) は個人の数と同じオーダーになるため、「高次元設定」に到達します。 したがって、生存回帰モデルの通常のアルゴリズム (例: R の coxph) は、パラメーターを推定し、臨床的に関連するイベントを特定することができません。 私たちの分析では、特にアルゴリズムレベルで、3 つの主な方法論的問題に特別な注意が必要です。

WP3 は 2 つの主要なステップに分けられます。最初のステップは、比較と統計アルゴリズムの開発に関するものです。 調整が完了すると、アルゴリズムが実行され、スプライシング イベントおよび/または臨床的に関連する LNCR 変異を含む予後バイオマーカーが特定されます。

高次元回帰モデルとなげなわアルゴリズム。 最初のステップでは、生存回帰モデルにおけるスプライシング変異と臨床的決定要因のみが考慮されます。 この場合、変数の選択とパラメーターの推定は、なげなわ (またはエラスティック ネット) アルゴリズムを使用して実行されます (Cox モデルについては Simon et al. を、Aalen モデルについては Gaiffas et al. を参照してください。どちらも R で実装されています)。

以前の出版物では、HSP110 T17 LNCR に大小の欠失がある患者群と、INCa でのエクソン 9 スキッピングによる変異体 HSP110 mRNA の発現が高いまたは低い患者群との間で、カットポイント値が最大の生存差をもたらすことが実証されました - PRTK 2014 20/51 mRNA レベル。 他のスプライシング イベントが同じしきい値効果を示す可能性があるため、最大 100 の候補スプライシング イベントのカット ポイントが慎重に決定されます。 古典的な統計においてさえ、カットポイントの決定は過検出のために既知の問題です。 関連するコンテキストで最近提案されたように、「プレスクリーニング アルゴリズムを使用したなげなわ」を適用して、カットポイントの決定をメイン アルゴリズムに組み込むことができます。

その他のポイント。 欠損データは、最近傍法または回帰法からの複数の代入によって処理されます。 この研究では、化学療法の使用との相互作用の可能性を検討します。 最後のステップとして、トレーニング コホート (Saint-Antoine) で推定が実行され、スプライシング イベントおよび/または臨床的に関連する LNCR 変異を含む予後バイオマーカーが導き出されます。 このバイオマーカーは、テスト コホート (多施設) で検証されます。 バイオマーカーを確認するためにブートストラップ分析が行われます。

WP4 - MSI がん細胞でスプライシングが高度に乱れている限られた数の臨床的に関連するがん関連遺伝子の機能研究を開始し、将来の臨床アッセイでのスクリーニングを簡素化するための生物学的ツールを開発すること。 前述のように、MSI CRC 細胞株と原発腫瘍の小さなシリーズでエクソン アレイを使用して予備研究が行われました (未発表)。 これは、実現可能性、時間、コスト、不利な要因、効果の大きさ (統計的変動性) を評価し、現在の本格的な研究プロジェクトを実施する前に研究デザインを改善するために実施されました。 検出された 100 の候補遺伝子 (その一部は RNAseq スクリーニングで同定されたものと重複する可能性があります) の機能は、高分子合成 (30%)、細胞増殖能または細胞死 (20%) などの癌関連プロセスに頻繁に関連していました。薬剤耐性 (10%) およびその他 (WNT 経路、転移プロセス、染色体構造の変化)。 現在のプロジェクトでは、臨床的に関連するいくつかの堅牢な MSI 駆動スプライス変異体を特定することが期待されています (上記の WP2 および WP3 を参照)。 これらの変異体は、腫瘍細胞に悪影響を及ぼしますが、一部 (HSP110 など) が高レベルで産生される可能性があることを考えると、発癌性または抗癌性の機能を持っている可能性があります (LNCR での MSI の予想される有害な影響に関する上記の機能仮説を参照してください)。 CRC）。 これに関連して、in vitro 機能研究は、少数 (n=5) の推定臨床的に関連する突然変異体の発癌性影響を特徴付けるために設計されます。 これらの実験は、siRNA またはプラスミドを使用した一時的なサイレンシングまたは過剰発現、および当研究室で既に利用可能な CRC 細胞モデルでのアドホックな生物学的読み出しに基づいています。

得られた結果に応じて、ヌードマウスに異種移植された安定にトランスフェクトされたCRCモデルを使用して、さらなる調査を計画できます。 さらに、生物学的ツールを検証するための研究計画 (例: HSP110 および HSP110DE9 変異体での研究と同様に、日常的なアッセイを使用して患者の将来のスクリーニングを最適化します。 組織マイクロアレイ (TMA) は、サン アントワーヌ病院の病理部門から遡及的に INCa - PRTK 2014 21/51 で収集された、定期的に調製され、ホルマリン固定され、パラフィン包埋されたブロックから構築されます。 腫瘍浸潤前部を含む新生物組織をサンプリングする(直径0.6mmの組織コアの3～6サンプル)。 可能であれば、ペアのリンパ節転移もサンプリングされます。 野生型または変異体候補タンパク質を認識するために特異的に生成された（下請け）抗体を用いた免疫組織化学がTMAで行われます。 エクソン スキッピング イベントは 2/3 のケースでフレーム シフトであるため、免疫原性の異常な C 末端テールを持つ切断型タンパク質が生成されます。 タンパク質発現と臨床病理学的特徴との相関関係、ならびにそれらの予後および予測値が評価されます。 TMA スライド画像は高解像度デジタル ファイルとしてキャプチャされ、各染色の評価は 2 人の病理学者によって行われます。