Avvikende spleisinger på grunn av mikrosatellitt-ustabilitet i tykktarmskreft: Fysiopatologisk og klinisk påvirkning

WP1 - For å identifisere ekson/intron-kryss som er spesifikt påvirket av avvikende spleisehendelser i MSI CRC. Sekvenser vil først bli evaluert ved CNG ved hjelp av Illuminas Pipeline CASAVA (Consensus Assessment of Sequence And Variation) programvare. Dette programmet konverterer intensitetspoeng til baseanrop, kvalitetspoengjusteringer og tilleggsformater for nedstrømsanalyse, og transformerer dermed raskt data til biologisk relevant informasjon. De filtrerte dataene vil deretter bli overført til CIT-plattformen (Carte d'Identité des Tumeurs; http://cit.ligue-cancer.net, dir: A. de Reynies) som skal analyseres av vår bioinformatikkekspert. Arbeidsflyten for mansjettknapper vil bli brukt til å kvantifisere transkripsjonsuttrykksnivåer i MSI-svulster. Dette tillater transkripsjonssammenstilling, oppdagelse og differensielle uttrykksmål ved oppløsning på transkripsjonsnivå. Fordi standard arbeidsflyt for Cufflinks ikke støtter oppdagelse eller kvantifisering av genfusjon, vil flere nye funksjoner bli innlemmet i den. For det første vil SoapFuse bli brukt til å oppdage fusjonsbruddpunkter og forutsi fusjonskrysssekvenser. Disse vil bli integrert i det menneskelige referansegenomet og genannoteringen fra Gencode-prosjektet for å gi en omfattende, integrert annotering av gentrekk for kartlegging av spleiseavlesninger. Integreringsprosessen INCa - PRTK 2014 17/51 vil følge flere regler for å minimere potensialet for å forstyrre kvantifiseringen av uttrykksnivå i kommende analyser. Ved hjelp av vårt tilpassede referansegenom og annotering, vil TopHat, en aligner som støtter spleisekryss og genfusjonskartlegging bli brukt for RNASeq-kartlegging. Mansjettknapper vil deretter bli brukt til å finne nye spleisevarianter, inkludert nye exon-hopping-isoformer.

Disse vil bli integrert i merknaden ved hjelp av Cuffmerge. Avhengig av justeringsresultatene oppnådd med TopHat, vil flere filtre bli brukt for å fjerne lavkvalitetskandidater for spleisevariasjon og genfusjon, samt kandidater som er inkompatible med eksisterende kommenterte transkripsjoner. Der det er nødvendig, vil avlesninger bli satt sammen av AbySS og deretter justert på referansegenomet av BLAT for å gi mer informasjon for å avgrense merknaden. Dette vil produsere en transkriptomsammenstilling som inneholder høysikkerhetsgenfusjon og eksonhoppingshendelser. Identifikasjon av disse hendelsene vil deretter bli utført i individuelle prøver. Cuffdiff vil bli brukt til å analysere kartleggingsresultatet, også basert på denne transkriptomsammenstillingen, for å kalle differensielt uttrykte gener og transkripsjoner og for å oppdage differensielle spleiseendringer. Til slutt vil CummeRbund brukes til å tolke og visualisere resultatene.

Påliteligheten til RNA-seq-analyse vil bli verifisert ved å søke etter avvikende spleisede transkripsjoner som allerede er rapportert i MSI-kreft (f. MRE11 og HSP110) og for punktmutasjoner i kodingssekvensene til målgener for MSI (f.eks. TGFBR2, IGF2R, TCF7L2, AXIN2, PTEN, RIZ) og i andre kreftrelaterte gener som fungerer som interne positive kontroller (f.eks. KRAS, BRAF, TP53, PIK3CA). Det er verdt å merke seg at dette prosjektet er en del av flere andre utviklet sammen med CIT-Ligue og som er rettet mot å karakterisere MSI CRC ved å bruke Omics-teknologier. Viktigere er at disse dataene allerede er tilgjengelige for et betydelig antall prøver og kan derfor utnyttes om nødvendig.

Data fra RNASeq-kohorten av pasienter vil bli omfattende analysert for å identifisere tilbakevendende skjøteavvik (forventet å være for det meste eksonhopping) som forekommer spesifikt i MSI kolontumorer sammenlignet med MSS CRC og matchende normal tykktarmslimhinne. Blant disse vil studien fokusere på spleiseavvik som skyldes MSI og som påvirker eksoner med et flankerende oppstrøms intron som inneholder en ≥ 15 bp LNCR som er lokalisert ≤ 6 bp fra intron-exon-krysset (spleiseakseptorsted) (RNASeqMSI- exon forhåndsliste). Som nevnt ovenfor inneholder omtrent 2000 humane gener minst ett intron med en LNCR svært nær AG-spleiseakseptoren ved intron-ekson-krysset. Omtrent 100 menneskelige gener kan bli påvirket av tilbakevendende og spesifikke avvikende spleisehendelser på grunn av MSI i CRC (for det meste eksonhopping; utledet fra eksperimenter utført i en begrenset serie av CRC-cellelinjer og primære svulster ved bruk av eksonmatriser; foreløpige og upubliserte resultater).

WP2 - For å undersøke funksjonelle koblinger mellom MSI og avvikende spleisehendelser.

Etter RNASeq-analysen vil bekreftelse av de avvikende skjøtehendelsene på grunn av MSI være nødvendig ved å bruke en annen metodisk tilnærming for å eliminere falske positive hendelser. Dette vil oppnås med sanntids kvantitativ INCa - PRTK 2014 18/51 RT-PCR ved bruk av interne, spesifikke prober (Applied biosystems). For hvert hoppet over ekson i RNASeqMSI-ekson-pre-listen, vil et felles par forover- og reversprimere lokalisert i de flankerende eksonene bli designet.

To interne prober vil bli designet, plassert enten innenfor de hoppede eksonene eller som strekker seg over de flankerende eksonene ved deres kryss for å påvise henholdsvis normalt eller avvikende spleiset mRNA på en konkurrerende måte. Den er svært sensitiv og unngår også falske positive signaler på grunn av kontaminering med genomisk DNA. Kandidateksoner som vil bli beholdt er de som viser avvikende og tilbakevendende hopp i MSI CRC-cellelinjer og primære svulster sammenlignet med MSS CRC-kontroller.

I tråd med arbeidshypotesen vår vil studien avgjøre om hver bekreftet skjøteavvik er MSI-drevet. Dette vil oppnås som beskrevet tidligere for T17-delesjoner i intron 8 av HSP110 som ble identifisert spesifikt i MSI CRC og fører til ekson 9-hopping. Kort fortalt vil allelprofiler av tilstøtende intronisk LNCR (se ovenfor) bli analysert ved bruk av fluorescensbasert genotyping i panelet av MSI- og MSS CRC-cellelinjer, så vel som i den komplette serien av MSI primære svulster fra RNASeq-pasientkohorten og paret normal. slimhinne (for å vurdere polymorf status). Dette vil bli utført ved hjelp av samme metode utviklet tidligere i vårt laboratorium for analyse av HSP110 T17 DNA-repetisjonen. Etter migrering av PCR-produkter på en ABI 3100 Genetic Analyzer med GS400HD ROX-størrelsesstandarder og POP-7-polymer (Applied Biosystems), vil GeneMapper V4.0-programvare (Applied Biosystems) brukes til å analysere LNCR-spor, med anvendelse av en AFLP (Amplified) Fragment Length Polymorphism) metode. Spor vil anses som akseptable når toppamplitudene er mellom 100 og 6000 fluorescensenheter. Et MSI Perl-skript er utviklet for automatisk å sammenligne LNCR-spor i normale prøver og tumorprøver, og dermed tillate deteksjon av avvikende LNCR-topper som faller utenfor den polymorfe sonen observert i normalpopulasjonen. Som med HSP110, forventes det (i) å oppdage somatiske slettinger/innsettinger i noen av kandidat-LNCR-ene ved å bruke denne tilnærmingen, og (ii) å identifisere de hvis somatiske endringer på grunn av MSI er signifikant assosiert med eksonhopprelaterte hendelser ved RNA-nivå (MSI ekson endelig liste).

WP3 - For å identifisere spleisehendelser og/eller LNCR-mutasjoner med klinisk relevans hos MSI CRC-pasienter. Den kliniske relevansen til kandidatgener (MSI exon final list) vil bli vurdert ved bruk av multivariate overlevelsesregresjonsmodeller for RFS (Relapse-Free Survival). Antallet spleisingskandidater og/eller LNCR-mutasjoner er omtrent 100 (se WP1 og WP2 ovenfor) og INCa - PRTK 2014 19/51 andre kjente kliniske determinanter som stadium, behandling og alder ved diagnose vil bli vurdert i de multivariate modellene. Falske positiver er en av de største fallgruvene når det gjelder å identifisere potensielt relevante markører blant dusinvis av kandidater. Siden antallet (p) av kovariater som skal vurderes vil være av samme størrelsesorden som antall individer, vil den "høydimensjonale innstillingen" nås. Følgelig vil de vanlige algoritmene for overlevelsesregresjonsmodeller (f. coxph i R) vil ikke estimere parametrene og identifisere hendelser med klinisk relevans. I vår analyse krever tre hovedmetodiske problemstillinger spesiell oppmerksomhet, spesielt på det algoritmiske nivået.

WP3 vil bli delt inn i to hovedtrinn, hvorav det første gjelder sammenligninger og utvikling av statistiske algoritmer. Når de er innstilt, vil algoritmene kjøres for å identifisere en prognostisk biomarkør(er) som involverer spleisehendelser og/eller LNCR-mutasjoner med klinisk relevans.

Høydimensjonale regresjonsmodeller og lassoalgoritmer. I det første trinnet vil kun spleisemutasjoner og kliniske determinanter i overlevelsesregresjonsmodellene bli vurdert. I dette tilfellet vil variabelseleksjon og parameterestimering bli utført med en lasso (eller elastisk nett) algoritme (se Simon et al. for Cox-modellen, og Gaiffas et al. for Aalen-modellen, begge implementert i R).

I tidligere publikasjoner ble det vist at cut-point-verdier resulterte i maksimale overlevelsesforskjeller mellom pasientgrupper med store eller små delesjoner i HSP110 T17 LNCR, og med høy eller lav ekspresjon av mutant HSP110 mRNA på grunn av ekson 9-hopping ved INCa - PRTK 2014 20/51 mRNA-nivå. Siden andre spleisehendelser kan ha samme terskeleffekt, vil skjæringspunktene for opptil 100 kandidatskjøtehendelser bli nøye bestemt. Selv i klassisk statistikk er kuttpunktbestemmelse en kjent vanskelighet på grunn av overdeteksjon. Som nylig foreslått i en beslektet kontekst, kan "lassoen med forhåndsscreeningsalgoritme" tilpasses for å inkorporere kuttpunktbestemmelsen i hovedalgoritmen.

Andre punkter. Manglende data vil bli håndtert av flere imputasjoner fra nærmeste nabo eller regresjonsmetoder. Studien vil vurdere mulige interaksjoner ved bruk av kjemoterapi. Som et siste trinn vil estimeringer bli kjørt på treningskohorten (Saint-Antoine) for å utlede en prognostisk biomarkør som vil inkludere spleisehendelser og/eller LNCR-mutasjoner med klinisk relevans. Denne biomarkøren vil bli validert på testkohorten (multisenter). Bootstrap-analyse vil bli utført for å fastslå biomarkøren.

WP4 - Å sette i gang funksjonelle studier på et begrenset antall klinisk relevante, kreftrelaterte gener hvis spleising er sterkt forstyrret i MSI-kreftceller, og å utvikle biologiske verktøy for å forenkle screening i fremtidige kliniske analyser. Som nevnt tidligere, har en foreløpig studie blitt utført ved bruk av eksonmatriser i en liten serie av MSI CRC-cellelinjer og primære svulster (upublisert). Dette ble utført for å evaluere gjennomførbarhet, tid, kostnader, ugunstige faktorer, effektstørrelse (statistisk variasjon) og for å forbedre studiedesignet før det nåværende fullskala forskningsprosjektet ble utført. Funksjonene til de 100 påviste kandidatgenene (hvorav noen kan overlappe med de identifisert fra RNAseq-screening) var ofte relatert til kreftrelaterte prosesser som makromolekylær syntese (30%), celleproliferativ kapasitet eller celledød (20%), medikamentresistens (10%) og andre (WNT-vei, metastatisk prosess, endringer i kromosomstruktur). Det nåværende prosjektet forventer å identifisere flere robuste MSI-drevne spleisemutanter som er klinisk relevante (se WP2 og WP3 ovenfor). Disse mutantene kan ha enten onkogene eller antionkogene funksjoner, gitt at noen (som HSP110) kan produseres i høye nivåer selv om de har negative effekter på tumorcellen (se vår funksjonelle hypotese ovenfor angående den forventede skadelige påvirkningen av MSI ved LNCR i CRC). I denne sammenhengen vil in vitro funksjonelle studier bli designet for å karakterisere den onkogene effekten av et lite antall (n=5) antatte klinisk relevante mutanter. Disse eksperimentene vil være basert på forbigående demping eller overekspresjon ved bruk av siRNA eller plasmider og ad hoc biologisk avlesning i CRC-cellemodeller som allerede er tilgjengelige i vårt laboratorium.

Avhengig av de oppnådde resultatene, kan ytterligere undersøkelser planlegges ved å bruke stabilt transfekterte CRC-modeller xenografert i nakne mus. I tillegg har studieplanen for å validere biologiske verktøy (f.eks. Antistoffer) for å optimalisere fremtidig screening av pasienter ved bruk av rutineanalyser, lik vårt arbeid med HSP110 og HSP110DE9-mutanten. Tissue Microarrays (TMAs) vil bli konstruert fra rutinemessig preparerte, formalinfikserte og parafininnstøpte blokker samlet INCa - PRTK 2014 21/51 retrospektivt fra patologiavdelingen ved Saint-Antoine sykehus. Neoplastisk vev vil bli tatt prøver, inkludert tumorinvasiv front (3 til 6 prøver av 0,6 mm diameter vevskjerner). Når tilgjengelig, vil parede lymfeknutemetastaser også bli tatt prøver av. Immunhistokjemi med antistoffer generert spesifikt (underleverandører) for å gjenkjenne villtype- eller mutantkandidatproteiner vil bli utført på TMA. Exon-hopping-hendelser er rammeskifte i 2/3 av tilfellene og genererer dermed avkortede proteiner som har immunogene, avvikende C-terminale haler. Korrelasjoner mellom proteinekspresjon og klinisk-patologiske trekk vil bli evaluert, samt deres prognostiske og prediktive verdier. TMA lysbildebilder vil bli tatt som høyoppløselige digitale filer og evaluering av hver farging vil bli utført av to patologer.