Aberantní sestřihy v důsledku nestability mikrosatelitů u kolorektálního karcinomu: Fyziopatologický a klinický dopad

WP1 – Identifikace spojení exon/intron, která jsou specificky ovlivněna aberantními sestřihovými událostmi v MSI CRC. Sekvence budou nejprve vyhodnoceny na CNG pomocí softwaru Illumina Pipeline CASAVA (Consensus Assessment of Sequence And Variation). Tento program převádí skóre intenzity na základní hovory, srovnání hodnocení kvality a další formáty pro následnou analýzu, čímž rychle převádí data na biologicky relevantní informace. Filtrovaná data budou poté přenesena na platformu CIT (Carte d'Identité des Tumeurs; http://cit.ligue-cancer.net, režie: A. de Reynies), který bude analyzovat náš odborník na bioinformatiku. Pracovní postup Cufflinks bude použit ke kvantifikaci úrovní exprese transkriptů v nádorech MSI. To umožňuje sestavení transkriptu, objev a měření diferenciální exprese při rozlišení na úrovni transkriptu. Protože standardní pracovní postup Cufflinks nepodporuje objevování nebo kvantifikaci genové fúze, bude do něj začleněno několik nových funkcí. Za prvé, SoapFuse bude použit k detekci bodů zlomu fúze a k predikci sekvencí fúzních spojů. Ty budou integrovány do lidského referenčního genomu a genové anotace z projektu Gencode, aby poskytly komplexní, integrovanou anotaci genových vlastností pro mapování sestřihových čtení. Proces integrace INCa - PRTK 2014 17/51 se bude řídit několika pravidly, aby se minimalizovala možnost narušení kvantifikace úrovně exprese v nadcházejících analýzách. S pomocí našeho přizpůsobeného referenčního genomu a anotace bude pro mapování RNASeq použit TopHat, aligner, který podporuje sestřihové spojení a mapování genové fúze. Manžetové knoflíčky pak poslouží k nalezení nových sestřihových variant, včetně nových izoforem s přeskočením exonu.

Ty budou integrovány do anotace pomocí Cuffmerge. V závislosti na výsledcích zarovnání získaných pomocí TopHat bude použito několik filtrů k odstranění kandidátů nízké kvality pro sestřihovou variaci a genovou fúzi, stejně jako kandidátů, kteří jsou nekompatibilní s existujícími anotovanými transkripty. Tam, kde je to nutné, budou čtení sestavena pomocí AbySS a poté srovnána s referenčním genomem pomocí BLAT, aby poskytla více informací pro upřesnění anotace. To vytvoří transkriptomovou sestavu obsahující vysoce spolehlivou genovou fúzi a události přeskočení exonu. Identifikace těchto událostí bude následně provedena v jednotlivých vzorcích. Cuffdiff bude použit k analýze výsledku mapování, rovněž založeného na tomto sestavení transkriptomu, pro volání odlišně exprimovaných genů a transkriptů a pro detekci diferenciálních sestřihových změn. Nakonec bude CummerRbund použit k interpretaci a vizualizaci výsledků.

Spolehlivost analýzy RNA-seq bude ověřena hledáním aberantně sestřižených transkriptů již hlášených u rakoviny MSI (např. MRE11 a HSP110) a pro bodové mutace v kódujících sekvencích cílových genů pro MSI (např. TGFBR2, IGF2R, TCF7L2, AXIN2, PTEN, RIZ) a v jiných genech souvisejících s rakovinou, které slouží jako vnitřní pozitivní kontroly (např. KRAS, BRAF, TP53, PIK3CA). Stojí za zmínku, že tento projekt je součástí několika dalších vyvinutých společně s CIT-Ligue, které jsou zaměřeny na charakterizaci MSI CRC pomocí technologií Omics. Důležité je, že tato data jsou již k dispozici pro značný počet vzorků a mohla by být proto v případě potřeby využita.

Data z kohorty pacientů s RNASeq budou komplexně analyzována za účelem identifikace rekurentních sestřihových aberací (očekává se, že většinou půjde o přeskočení exonu), které se vyskytují specificky u MSI nádorů tlustého střeva ve srovnání s MSS CRC a odpovídající normální sliznici tlustého střeva. Mezi nimi se studie zaměří na sestřihové aberace, které jsou způsobeny MSI a které ovlivňují exony s lemujícím upstream intronem obsahujícím LNCR ≥ 15 bp, který se nachází ≤ 6 bp od spojení intron-exon (místo akceptoru sestřihu) (RNASeqMSI- předběžný seznam exonů). Jak je uvedeno výše, asi 2000 lidských genů obsahuje alespoň jeden intron s LNCR velmi blízko k akceptorovému místu AG sestřihu na spojení intron-exon. Přibližně 100 lidských genů by mohlo být ovlivněno rekurentními a specifickými aberantními sestřihovými událostmi v důsledku MSI v CRC (většinou přeskočení exonu; odvozeno z experimentů provedených v omezené sérii buněčných linií CRC a primárních nádorů pomocí polí exonů; předběžné a nepublikované výsledky).

WP2 - Prozkoumat funkční spojení mezi MSI a aberantními sestřihovými událostmi.

Po analýze RNASeq bude vyžadováno potvrzení aberantních sestřihových událostí způsobených MSI pomocí jiného metodického přístupu, aby se eliminovaly falešně pozitivní události. Toho bude dosaženo kvantitativní INCa v reálném čase - PRTK 2014 18/51 RT-PCR pomocí interních, specifických sond (Applied biosystems). Pro každý přeskočený exon v předběžném seznamu RNASeqMSI-exonů bude navržen společný pár přímých a reverzních primerů umístěných v přilehlých exonech.

Budou navrženy dvě vnitřní sondy, umístěné buď uvnitř přeskočených exonů, nebo pokrývající lemující exony v jejich spojení, aby bylo možné kompetitivním způsobem detekovat normální nebo aberantně sestřiženou mRNA. Je vysoce citlivý a také se vyhýbá falešně pozitivním signálům v důsledku kontaminace genomovou DNA. Kandidátské exony, které budou zachovány, jsou ty, které vykazují aberantní a opakující se přeskakování v buněčných liniích MSI CRC a primárních nádorech ve srovnání s kontrolami MSS CRC.

V souladu s naší pracovní hypotézou pak studie určí, zda je každá potvrzená sestřihová aberace způsobena MSI. Toho bude dosaženo, jak bylo popsáno dříve pro T17 delece v intronu 8 HSP110, které byly identifikovány specificky v MSI CRC a vedly k přeskočení exonu 9. Stručně řečeno, alelické profily sousedních intronických LNCR (viz výše) budou analyzovány pomocí genotypizace založené na fluorescenci v panelu MSI a MSS CRC buněčných linií, stejně jako v kompletní sérii MSI primárních nádorů z kohorty pacientů s RNASeq a spárovaných normálních sliznice (za účelem posouzení polymorfního stavu). To bude provedeno pomocí stejné metody vyvinuté dříve v naší laboratoři pro analýzu repetice DNA HSP110 T17. Po migraci produktů PCR na genetický analyzátor ABI 3100 s velikostními standardy GS400HD ROX a polymerem POP-7 (Applied Biosystems) bude k analýze stop LNCR použit software GeneMapper V4.0 (Applied Biosystems) s aplikací AFLP (Amplified Metoda polymorfismu délky fragmentu. Stopy budou považovány za přijatelné, pokud jsou amplitudy píku mezi 100 a 6 000 fluorescenčními jednotkami. Skript MSI Perl byl vyvinut pro automatické porovnání křivek LNCR v normálních a nádorových vzorcích, což umožňuje detekci aberantních vrcholů LNCR, které spadají mimo polymorfní zónu pozorovanou u normální populace. Stejně jako u HSP110 se očekává (i) detekce somatických delecí/inzercí v některých kandidátských LNCR pomocí tohoto přístupu a (ii) identifikace těch, jejichž somatické změny způsobené MSI jsou významně spojeny s událostmi souvisejícími s přeskočením exonu v Úroveň RNA (konečný seznam MSI exonů).

WP3 – Identifikovat sestřihové události a/nebo mutace LNCR s klinickým významem u pacientů s MSI CRC. Klinická relevance kandidátních genů (konečný seznam MSI exonů) bude hodnocena pomocí vícerozměrných regresních modelů přežití pro RFS (Relapse-Free Survival). Počet kandidátních sestřihových událostí a/nebo mutací LNCR je přibližně 100 (viz WP1 a WP2 výše) a v multivariačních modelech budou zvažovány další známé klinické determinanty, jako je stadium, léčba a věk v době diagnózy. Falešná pozitiva jsou jedním z hlavních úskalí při identifikaci potenciálně relevantních markerů mezi desítkami kandidátů. Vzhledem k tomu, že počet (p) kovariát, které je třeba vzít v úvahu, bude stejného řádu jako počet jedinců, bude dosaženo "vysokorozměrného nastavení". V důsledku toho obvyklé algoritmy pro modely regrese přežití (např. coxph v R) nedokáže odhadnout parametry a identifikovat události s klinickým významem. V naší analýze vyžadují zvláštní pozornost tři hlavní metodologické problémy, zejména na úrovni algoritmů.

WP3 bude rozdělen do dvou hlavních kroků, z nichž první se týká porovnávání a vývoje statistických algoritmů. Po vyladění budou algoritmy spuštěny k identifikaci prognostického biomarkeru (biomarkerů), který zahrnuje sestřihové události a/nebo mutace LNCR s klinickým významem.

Vysokorozměrné regresní modely a lasové algoritmy. V prvním kroku budou uvažovány pouze sestřihové mutace a klinické determinanty v modelech regrese přežití. V tomto případě bude výběr proměnných a odhad parametrů proveden pomocí algoritmu lasa (nebo elastické sítě) (viz Simon a kol. pro Coxův model a Gaiffas a kol. pro Aalenův model, oba implementované v R).

V předchozích publikacích bylo prokázáno, že hraniční hodnoty vedly k maximálním rozdílům v přežití mezi skupinami pacientů s velkými nebo malými delecemi v HSP110 T17 LNCR a s vysokou nebo nízkou expresí mutantní HSP110 mRNA v důsledku přeskočení exonu 9 na INCa - PRTK 2014 20/51 úroveň mRNA. Vzhledem k tomu, že jiné sestřihové události mohou mít stejný prahový efekt, budou pečlivě stanoveny hraniční body až pro 100 kandidátských sestřihových událostí. I v klasické statistice je určování mezního bodu známou obtíží kvůli nadměrné detekci. Jak bylo nedávno navrženo v souvisejícím kontextu, "laso s předběžným screeningovým algoritmem" by mohlo být upraveno tak, aby začlenilo určení mezního bodu do hlavního algoritmu.

Další body. Chybějící data budou zpracována vícenásobnými imputacemi z nejbližšího souseda nebo regresními metodami. Studie zváží možné interakce s použitím chemoterapie. Jako poslední krok budou provedeny odhady na tréninkové kohortě (Saint-Antoine), aby se získal prognostický biomarker, který bude zahrnovat sestřihové události a/nebo mutace LNCR s klinickým významem. Tento biomarker bude validován na testovací kohortě (multicentru). Pro zjištění biomarkeru bude provedena bootstrap analýza.

WP4 – Zahájit funkční studie na omezeném počtu klinicky relevantních genů souvisejících s rakovinou, jejichž sestřih je v rakovinných buňkách MSI vysoce narušen, a vyvinout biologické nástroje pro zjednodušení screeningu v budoucích klinických testech. Jak bylo uvedeno dříve, byla provedena předběžná studie s použitím exonových polí v malé sérii MSI CRC buněčných linií a primárních nádorů (nepublikováno). To bylo provedeno za účelem vyhodnocení proveditelnosti, času, nákladů, nepříznivých faktorů, velikosti účinku (statistická variabilita) a ke zlepšení návrhu studie před provedením tohoto výzkumného projektu v plném rozsahu. Funkce 100 detekovaných kandidátních genů (některé z nich se mohou překrývat s těmi identifikovanými ze screeningu RNAseq) často souvisely s procesy souvisejícími s rakovinou, jako je makromolekulární syntéza (30 %), buněčná proliferační kapacita nebo buněčná smrt (20 %), léková rezistence (10 %) a další (WNT dráha, metastatický proces, změny ve struktuře chromozomů). Tento projekt předpokládá identifikaci několika robustních sestřihových mutantů řízených MSI, které jsou klinicky relevantní (viz WP2 a WP3 výše). Tyto mutanty mohou mít buď onkogenní nebo antionkogenní funkce, protože některé (jako HSP110) mohou být produkovány ve vysokých hladinách, i když mají negativní dopad na nádorovou buňku (viz naše funkční hypotéza výše týkající se očekávaného škodlivého vlivu MSI na LNCR v CRC). V této souvislosti budou navrženy funkční studie in vitro, aby charakterizovaly onkogenní dopad malého počtu (n=5) domnělých klinicky relevantních mutantů. Tyto experimenty budou založeny na přechodném umlčení nebo nadměrné expresi pomocí siRNA nebo plazmidů a ad hoc biologickém čtení v buněčných modelech CRC, které jsou již dostupné v naší laboratoři.

V závislosti na získaných výsledcích by pak mohly být naplánovány další výzkumy s použitím stabilně transfekovaných CRC modelů xenoimplantovaných do nahých myší. Kromě toho studijní plán na ověření biologických nástrojů (např. Protilátky), abychom optimalizovali budoucí screening pacientů pomocí rutinních testů, podobně jako naše práce s HSP110 a mutantem HSP110DE9. Tkáňové mikročipy (TMA) budou zkonstruovány z rutinně připravených bloků fixovaných ve formalínu a zalitých do parafínu odebraných zpětně INCa - PRTK 2014 21/51 z patologického oddělení nemocnice Saint-Antoine. Budou odebrány vzorky neoplastické tkáně, včetně invazivní fronty nádoru (3 až 6 vzorků tkáňových jader o průměru 0,6 mm). Jsou-li k dispozici, budou také odebrány vzorky párových metastáz v lymfatických uzlinách. Na TMA bude provedena imunohistochemie s protilátkami vytvořenými specificky (subdodavatelsky) pro rozpoznání standardních nebo mutantních kandidátních proteinů. Události přeskakování exonu jsou ve 2/3 případů posunuty a tak generují zkrácené proteiny, které mají imunogenní, aberantní C-terminální konce. Budou vyhodnoceny korelace mezi expresí proteinů a klinicko-patologickými znaky a jejich prognostické a prediktivní hodnoty. Snímky TMA budou zachyceny jako digitální soubory s vysokým rozlišením a hodnocení každého barvení provedou dva patologové.