대장암에서 현미부수체 불안정성에 의한 비정상적인 접합: 생리병리학적 및 임상적 영향

WP1 - MSI CRC에서 비정상적인 스플라이싱 이벤트에 의해 특별히 영향을 받는 엑손/인트론 접합을 식별합니다. 시퀀스는 Illumina의 Pipeline CASAVA(Sequence And Variation에 대한 합의 평가) 소프트웨어를 사용하여 CNG에서 먼저 평가됩니다. 이 프로그램은 강도 점수를 베이스 콜, 품질 점수 정렬 및 다운스트림 분석을 위한 추가 형식으로 변환하여 데이터를 생물학적으로 관련된 정보로 빠르게 변환합니다. 필터링된 데이터는 CIT 플랫폼(Carte d'Identité des Tumeurs; http://cit.ligue-cancer.net, dir: A. de Reynies)를 생물정보학 전문가가 분석합니다. Cufflinks 작업 흐름은 MSI 종양의 전사체 발현 수준을 정량화하는 데 사용됩니다. 이를 통해 전사체 수준 해상도에서 전사체 조립, 발견 및 차등 발현 측정이 가능합니다. 표준 Cufflinks 작업 흐름은 유전자 융합 발견 또는 정량화를 지원하지 않기 때문에 몇 가지 새로운 기능이 여기에 통합됩니다. 첫째, SoapFuse는 융합 중단점을 감지하고 융합 접합 시퀀스를 예측하는 데 사용됩니다. 이들은 Gencode 프로젝트의 인간 참조 게놈 및 유전자 주석에 통합되어 스플라이싱 판독 매핑을 위한 포괄적이고 통합된 유전자 기능 주석을 제공합니다. 통합 INCa - PRTK 2014 17/51 프로세스는 향후 분석에서 발현 수준의 정량화를 방해할 가능성을 최소화하기 위해 몇 가지 규칙을 준수합니다. 맞춤형 참조 게놈 및 주석의 도움으로 splice junction 및 유전자 융합 매핑을 지원하는 얼라이너인 TopHat이 RNASeq 매핑에 사용될 것입니다. 그런 다음 커프스 단추를 사용하여 새로운 엑손 건너뛰기 이소형을 포함하여 새로운 스플라이스 변형을 찾습니다.

이들은 Cuffmerge를 사용하여 주석에 통합됩니다. TopHat으로 얻은 정렬 결과에 따라 스플라이스 변이 및 유전자 융합에 대한 낮은 품질의 후보와 기존 주석이 달린 전사본과 호환되지 않는 후보를 제거하기 위해 여러 필터가 적용됩니다. 필요한 경우 AbySS에 의해 읽기가 조립된 다음 BLAT에 의해 참조 게놈에 정렬되어 주석 정제를 위한 추가 정보를 제공합니다. 이는 신뢰도가 높은 유전자 융합 및 엑손 건너뛰기 이벤트를 포함하는 전사체 어셈블리를 생성합니다. 이러한 이벤트의 식별은 개별 샘플에서 수행됩니다. Cuffdiff는 차등적으로 발현된 유전자 및 전사체를 호출하고 차등 스플라이싱 변화를 검출하기 위해 이 전사체 어셈블리를 기반으로 매핑 결과를 분석하는 데 사용될 것입니다. 마지막으로 CummeRbund를 사용하여 결과를 해석하고 시각화합니다.

RNA-seq 분석의 신뢰성은 MSI 암(예: MRE11 및 HSP110) 및 MSI(예: TGFBR2, IGF2R, TCF7L2, AXIN2, PTEN, RIZ)에 대한 표적 유전자의 코딩 서열 및 내부 양성 대조군(예: KRAS, BRAF, TP53, PIK3CA). 이 프로젝트는 CIT-Ligue와 공동으로 개발되었으며 Omics 기술을 사용하여 MSI CRC를 특성화하는 것을 목표로 하는 다른 여러 프로젝트의 일부라는 점은 주목할 가치가 있습니다. 중요한 것은 이 데이터가 이미 상당한 수의 샘플에 대해 사용 가능하므로 필요한 경우 악용될 수 있다는 것입니다.

환자의 RNASeq 코호트 데이터를 종합적으로 분석하여 MSS CRC 및 일치하는 정상 결장 점막과 비교하여 MSI 결장 종양에서 특이적으로 발생하는 재발성 스플라이싱 이상(대부분 엑손 스키핑으로 예상됨)을 식별합니다. 이 중에서 이 연구는 인트론-엑손 접합부(스플라이스 수용자 부위)(RNASeqMSI- 엑손 사전 목록). 위에서 언급한 바와 같이, 약 2,000개의 인간 유전자는 인트론-엑손 접합부에서 AG 스플라이스 수용자 부위에 매우 가까운 LNCR을 가진 적어도 하나의 인트론을 포함합니다. 약 100개의 인간 유전자가 CRC의 MSI로 인한 반복적이고 특정한 비정상적인 스플라이싱 사건에 의해 영향을 받을 수 있습니다(대부분 엑손 건너뛰기; 엑손 어레이를 사용하여 제한된 일련의 CRC 세포주 및 원발성 종양에서 수행된 실험에서 추론; 예비 및 미발표 결과).

WP2 - MSI와 비정상적인 스플라이싱 이벤트 사이의 기능적 연결을 조사합니다.

RNASeq 분석 후 MSI로 인한 비정상 스플라이싱 이벤트의 확인은 위양성 이벤트를 제거하기 위해 다른 방법론적 접근 방식을 사용해야 합니다. 이것은 내부의 특정 프로브(Applied biosystems)를 사용하는 실시간 정량적 INCa - PRTK 2014 18/51 RT-PCR로 달성됩니다. RNASeqMSI-엑손 사전 목록에서 건너뛴 각 엑손에 대해 측면 엑손에 위치한 정방향 및 역방향 프라이머의 공통 쌍이 설계됩니다.

2개의 내부 프로브가 각각 경쟁 방식으로 정상 또는 비정상적으로 스플라이싱된 mRNA를 검출하기 위해 건너뛴 엑손 내에 위치하거나 접합부에서 측면 엑손에 걸쳐 있도록 설계될 것입니다. 매우 민감하며 게놈 DNA 오염으로 인한 위양성 신호를 방지합니다. 유지될 후보 엑손은 MSS CRC 대조군과 비교하여 MSI CRC 세포주 및 원발성 종양에서 비정상적이고 반복적인 건너뛰기를 나타내는 것들이다.

작업 가설에 따라 이 연구는 확인된 각 접합 수차가 MSI로 인한 것인지 여부를 결정할 것입니다. 이는 MSI CRC에서 구체적으로 식별되고 엑손 9 건너뛰기로 이어지는 HSP110의 인트론 8에서 T17 결실에 대해 앞서 설명한 바와 같이 달성될 것입니다. 간략하게, 인접한 인트론 LNCR(위 참조)의 대립형질 프로파일은 MSI 및 MSS CRC 세포주의 패널뿐만 아니라 RNASeq 환자 코호트 및 짝을 이룬 정상적인 MSI 원발성 종양의 전체 시리즈에서 형광 기반 유전자형 분석을 사용하여 분석됩니다. 점막(다형성 상태를 평가하기 위해). 이것은 HSP110 T17 DNA 반복 분석을 위해 우리 실험실에서 초기에 개발된 동일한 방법을 사용하여 수행됩니다. GS400HD ROX 크기 표준 및 POP-7 폴리머(Applied Biosystems)가 포함된 ABI 3100 유전자 분석기에서 PCR 산물을 마이그레이션한 후 GeneMapper V4.0 소프트웨어(Applied Biosystems)는 AFLP(Amplified 단편 길이 다형성) 방법. 피크 진폭이 100에서 6,000 형광 단위 사이일 때 추적이 허용되는 것으로 간주됩니다. MSI Perl 스크립트는 정상 및 종양 샘플의 LNCR 추적을 자동으로 비교하기 위해 개발되었으므로 정상 인구에서 관찰된 다형성 영역 외부에 있는 비정상적인 LNCR 피크를 감지할 수 있습니다. HSP110과 마찬가지로, (i) 이 접근 방식을 사용하여 후보 LNCR 중 일부에서 체세포 결실/삽입을 감지하고 (ii) MSI로 인한 체세포 변형이 엑손 건너뛰기 관련 이벤트와 유의미하게 연관되어 있는 LNCR을 식별할 것으로 예상됩니다. RNA 수준(MSI 엑손 최종 목록).

WP3 - MSI CRC 환자에서 임상적 관련성이 있는 스플라이싱 사건 및/또는 LNCR 돌연변이를 확인합니다. RFS(Relapse-Free Survival)에 대한 다변량 생존 회귀 모델을 사용하여 후보 유전자(MSI 엑손 최종 목록)의 임상적 관련성을 평가합니다. 후보 스플라이싱 이벤트 및/또는 LNCR 돌연변이의 수는 약 100개(위의 WP1 및 WP2 참조)이며, INCa - PRTK 2014 19/51 병기, 치료 및 진단 시 연령과 같은 기타 알려진 임상 결정 요인이 다변량 모델에서 고려됩니다. 거짓 긍정은 수십 개의 후보 중에서 잠재적으로 관련이 있는 마커를 식별하는 데 있어 주요 함정 중 하나입니다. 고려되는 공변량의 수(p)는 개인의 수와 같은 순서이므로 "고차원 설정"에 도달하게 됩니다. 결과적으로 생존 회귀 모델에 대한 일반적인 알고리즘(예: R의 coxph)는 매개변수를 추정하고 임상 관련성이 있는 사건을 식별하지 못할 것입니다. 우리의 분석에서 특히 알고리즘 수준에서 세 가지 주요 방법론적 문제에 특별한 주의가 필요합니다.

WP3는 두 가지 주요 단계로 나뉘며, 첫 번째 단계는 비교 및 ​​통계 알고리즘 개발에 관한 것입니다. 일단 조정되면 알고리즘이 실행되어 임상 관련성이 있는 스플라이싱 이벤트 및/또는 LNCR 돌연변이를 포함하는 예후 바이오마커를 식별합니다.

고차원 회귀 모델 및 올가미 알고리즘. 첫 번째 단계에서는 생존 회귀 모델의 스플라이싱 돌연변이 및 임상 결정인자만 고려됩니다. 이 경우 변수 선택 및 매개변수 추정은 lasso(또는 탄성망) 알고리즘으로 수행됩니다(Cox 모델의 경우 Simon et al., Aalen 모델의 경우 Gaiffas et al. 참조, 둘 다 R로 구현됨).

이전 간행물에서는 절단점 값이 HSP110 T17 LNCR에서 크거나 작은 결실이 있는 환자 그룹과 INCa - PRTK에서 건너뛰는 엑손 9로 인해 돌연변이 HSP110 mRNA의 발현이 높거나 낮은 환자 그룹 간에 최대 생존 차이를 초래한다는 것이 입증되었습니다. 2014 20/51 mRNA 수준. 다른 스플라이싱 이벤트가 동일한 임계값 효과로 나타날 수 있으므로 최대 100개의 후보 스플라이싱 이벤트에 대한 컷 포인트가 신중하게 결정됩니다. 고전 통계에서도 컷 포인트 결정은 과잉 감지로 인해 알려진 어려움입니다. 관련 맥락에서 최근에 제안된 바와 같이, "사전 스크리닝 알고리즘이 있는 올가미"는 컷 포인트 결정을 기본 알고리즘에 통합하도록 조정될 수 있습니다.

기타 사항. 누락된 데이터는 가장 가까운 이웃 또는 회귀 방법의 다중 전가로 처리됩니다. 연구는 화학 요법 사용과 가능한 상호 작용을 고려할 것입니다. 마지막 단계로 훈련 코호트(Saint-Antoine)에서 추정을 실행하여 임상 관련성이 있는 스플라이싱 이벤트 및/또는 LNCR 돌연변이를 포함할 예후 바이오마커를 도출합니다. 이 바이오마커는 테스트 코호트(다중 센터)에서 검증됩니다. 부트스트랩 분석을 수행하여 바이오마커를 확인합니다.

WP4 - MSI 암 세포에서 스플라이싱이 크게 교란되는 제한된 수의 임상적으로 관련된 암 관련 유전자에 대한 기능 연구를 시작하고 향후 임상 분석에서 스크리닝을 단순화하기 위한 생물학적 도구를 개발합니다. 앞서 언급한 바와 같이, 작은 일련의 MSI CRC 세포주 및 원발성 종양(미발표)에서 엑손 어레이를 사용하여 예비 연구가 수행되었습니다. 이는 현재의 본격적인 연구 프로젝트를 수행하기 전에 타당성, 시간, 비용, 부작용, 효과 크기(통계적 변동성)를 평가하고 연구 설계를 개선하기 위해 수행되었습니다. 100개의 검출된 후보 유전자의 기능(일부는 RNAseq 스크리닝에서 확인된 것과 중복될 수 있음)은 거대분자 합성(30%), 세포 증식 능력 또는 세포 사멸(20%)과 같은 암 관련 과정과 자주 관련이 있었습니다. 약물 내성(10%) 및 기타(WNT 경로, 전이 과정, 염색체 구조의 변화). 현재 프로젝트는 임상적으로 관련된 몇 가지 강력한 MSI 구동 스플라이스 돌연변이를 식별할 것으로 기대합니다(위의 WP2 및 WP3 참조). 이러한 돌연변이는 종양 세포에 부정적인 영향을 미치더라도 일부(예: HSP110)가 높은 수준으로 생산될 수 있다는 점을 감안할 때 발암 또는 항암 기능을 가질 수 있습니다(LNCR에서 MSI의 예상되는 해로운 영향에 관한 위의 기능적 가설 참조). CRC). 이러한 맥락에서, 시험관 내 기능 연구는 추정되는 임상 관련 돌연변이의 소수(n=5)의 발암성 영향을 특성화하도록 설계될 것입니다. 이 실험은 우리 실험실에서 이미 사용 가능한 CRC 세포 모델의 임시 생물학적 판독 및 siRNA 또는 플라스미드를 사용한 일시적 침묵 또는 과발현을 기반으로 합니다.

얻은 결과에 따라 누드 마우스에 이종이식된 안정적으로 형질감염된 CRC 모델을 사용하여 추가 조사를 계획할 수 있습니다. 또한 생물학적 도구(예: 항체) HSP110 및 HSP110DE9 돌연변이에 대한 작업과 유사하게 일상적인 분석을 사용하여 환자의 향후 스크리닝을 최적화합니다. 조직 마이크로어레이(Tissue Microarrays, TMA)는 Saint-Antoine 병원의 병리과에서 회고적으로 INCa - PRTK 2014 21/51 수집된 일상적으로 준비되고 포르말린 고정 및 파라핀 내장 블록으로 구성됩니다. 종양 침습 전두엽(0.6mm 직경 조직 코어의 3~6개 샘플)을 포함하여 종양 조직을 샘플링합니다. 가능한 경우 한 쌍의 림프절 전이도 샘플링됩니다. 야생형 또는 돌연변이 후보 단백질을 인식하기 위해 특이적으로 생성된(하도급) 항체를 사용한 면역조직화학이 TMA에서 수행될 것입니다. 엑손 건너뛰기 사건은 사례의 2/3에서 프레임 이동이며 따라서 면역원성, 비정상적인 C-말단 꼬리를 갖는 잘린 단백질을 생성합니다. 단백질 발현과 임상-병리학적 특징 사이의 상관관계와 예후 및 예측 값을 평가할 것입니다. TMA 슬라이드 이미지는 고해상도 디지털 파일로 캡처되며 각 염색에 대한 평가는 두 명의 병리학자가 수행합니다.