CF 真菌感染的免疫概况

虽然细菌是 CF 肺部疾病的主要病原体，但真菌通常在痰液和支气管肺泡灌洗液 (BAL) 中分离出来，但它们在 CF 中的作用尚不完全清楚。 CF 中的真菌感染具有广泛的表现，从短暂检测到持续性感染、急性真菌性支气管炎导致肺部恶化、对真菌过敏原敏感和过敏性支气管肺曲霉菌病 (ABPA)。 虽然有诊断和治疗 CF 患者 ABPA 的临床指南，但很少有关于 CF 真菌病各种表现的监测、临床护理和抗真菌治疗的指南和建议；此外，人们对不含 ABPA 的真菌的临床影响知之甚少。 虽然 CF 中的炎症通常被认为是中性粒细胞和巨噬细胞驱动的过程 (Th1)，但在临床和动物 CF 研究中，嗜酸性粒细胞和过敏性细胞因子 (Th2) 已显示在存在真菌疾病的情况下升高。 研究还表明肺功能下降（例如 预测一秒钟内用力呼气量的百分比，ppFEV1) 在经常在痰液中检测到真菌的个体中，以及与假单胞菌感染和抗菌药物使用的关联。 与非 CF 患者相比，患有 CF 的成年人也更容易发生真菌致敏，并且过敏性鼻炎和特应性的发生率更高。 在我们中心进行的一项回顾性研究中，我们发现无论 ABPA 状态如何，与没有真菌感染的儿童相比，患有间歇性或慢性真菌感染的儿童肺功能下降更快（见初步数据）。 了解真菌感染是否由过敏 (Th2) 炎症过程驱动可能会改变治疗方法，通过在真菌感染患者中更容易地使用类固醇和抗真菌疗法来对抗肺功能下降。 有限的研究调查了 CF 患者对真菌病原体的过敏性致敏频率、一般儿童 CF 人群的过敏性致敏频率，以及痰液和血清中 CF 真菌感染的独特炎症特征和表型。

假设：我们假设与没有真菌感染的儿童相比，患有 CF 和真菌感染但没有 ABPA 的儿童将具有更高的过敏性炎症特征和对真菌成分的敏感性增加。

具体目标 1：比较 CF 患者和 ABPA 患者中伴有和不伴有真菌感染的 Th2 炎症。

• 方法：我们将从 25 名以下患者中获取血清和痰液样本：(1) 没有 ABPA 的真菌感染，n=10（定义为在之前 18 个月内≥ 2 次真菌培养阳性），(2) 无真菌感染，n=10， (3) ABPA，n=5，并测量特定的痰液和血清细胞因子测量值，以评估 Th2 和 Th1 炎症通路。
• 测量的生物标志物：嗜酸性阳离子蛋白 (ECP)、白细胞介素 4 (IL4)、白细胞介素 5 (IL5)、白细胞介素 10 (IL10)、白细胞介素 13 (IL13) 以及血清和痰液中的嗜酸性粒细胞计数。
• 预期结果：与没有真菌感染的个体相比，没有 APBA 的真菌感染个体的 Th2 炎症标志物升高。 我们还将与 ABPA 作为单独的对照组进行比较。 我们还将测量 Th1 标记，以用作先前在 CF 中发现的炎症特征的参考，看看那些患有真菌疾病的人是否偏离了更多的 Th2 驱动过程。

具体目标 2：与没有真菌感染的患者和有 ABPA 的患者相比，研究没有 ABPA 的 CF 真菌感染患者对真菌成分的变态反应。

• 方法：我们将测量各种物种（曲霉菌、念珠菌等）的真菌蛋白的总 IgE 和特定 IgE 水平的血清 ImmunoCAP 测试。以确定真菌致敏。 我们还将调查患者的环境暴露情况，以探索与过敏性致敏的关系。
• 预期结果：与没有真菌感染的个体相比，没有 ABPA 的真菌感染个体更可能对真菌元素表现出过敏性致敏。

这项研究的结果将有助于表征与 CF 真菌感染相关的炎症特征，有助于了解 CF 人群中疾病的传染性和过敏性。 由此，对 CF 真菌感染的病理生理学和临床特征的贡献将有助于了解这一独特的难以治疗的生物体的管理选择、护理指南和疾病进展。

招募：我们建议招募 25 名年龄在 8 至 25 岁之间的 CF 患者，他们同意参加这项横断面研究，研究真菌感染和 ABPA 的免疫系统特征。 我们计划筛选前来他们常规 CF 诊所的个人，并就他们参与这项研究的兴趣与他们接洽。 由此，我们将解释与安排他们进行研究访问的意图有关的概念、假设和程序。

患者选择：患者将在常规门诊就诊时由研究调查员或合格的研究协调员从 CHCO 的 CF 中心招募。

研究访问：我们计划在临床稳定期间前瞻性地招募 25 名 CF 受试者。 受试者将进行一次研究门诊就诊，这与他们在 CHCO 肺科诊所设施的门诊就诊同时进行。 以下诊断信息将输入病例报告表：人口统计信息、诊断史和突变、CF 相关合并症、历史微生物学结果（包括真菌培养结果）、药物治疗（包括调节剂治疗和长期抗生素治疗方案）、既往过敏测试、 ABPA 的诊断标准（如果适用）。 我们还将利用病历中的历史临床数据来确定其他合并症、肺功能趋势和基线、其他细菌感染史、过敏诊断史以及其他相关病史和诊断测试（即以前的 CT 扫描结果、以前的血液检查等）。 将进行以下评估：

• 病历中的历史数据。 示例包括与 CF 相关的合并症诊断（例如但不限于 CF 相关糖尿病、CF 肝病、哮喘等）、既往血液检查（例如但不限于血清 IgE 水平、既往过敏测试、支气管镜检查数据和灌洗研究、常规和紧急/入院 CF 实验室等）、先前的肺活量计和肺功能数据、先前的营养和生长数据（BMI、维生素水平等）、先前的微生物学和培养数据等。
• 从定期 CF 门诊就诊获得的 BMI 测量值
• 获得并随后计算身高和体重。
• 从定期 CF 门诊就诊获得的肺功能测试。 肺活量测定法将根据美国胸科学会标准进行，而绝对值将转换为使用全球肺功能倡议参考方程 34 预测的百分比。
• 痰液采集。 将尽可能使用自发咳出的痰液。这将由患者在就诊后 12 小时内按照常规呼吸道清除方案在家中收集。 样本将被放置在邮寄的标本杯中并置于冰上并带到诊所就诊。 如果在就诊前无法咳出痰液，我们将尝试利用未用于临床需要的剩余痰液进行进一步分析和储存。 如果 1) 无法咳出，(2) 患者符合痰诱导的临床标准，并且 (3) 诊所能够根据当前的方法进行研究诱导痰，则可以根据当前 CFF 治疗发展网络标准操作程序通过痰诱导收集痰液确保团队成员安全和充足的 PPE 供应的 COVID-19 指南。

出于安全原因，仅对在诱导当天满足以下标准的受试者进行诱导程序：FEV1 ≥ 30% 预计值，就诊前 48 小时内无 > 5 mL 咯血史，能够耐受痰诱导程序。 值得注意的是，咳痰和诱导痰的分析标本质量几乎没有显着差异。 如前所述要测试的标记。

• 环境真菌暴露问卷。 将在门诊就诊结束前进行。 本问卷整体为刘德华博士使用的经过验证的问卷。 鉴于研究参与者的时间限制，我们正在使用修改后的问卷，重点关注对本研究感兴趣的问题（例如 关于真菌暴露）。 这尚未得到验证，但可能会在此试点研究中为未来的研究提供重要信息

• 血清采集。 外周静脉血抽取将由经认证的个人使用 CTRC 的适当无菌技术进行。 样本将根据研究协议标准进行标记。 上述要测试的标记。

  • 所有痰液样本都将被储存和保存，用于潜在的微生物组、真菌组和转录组分析，评估各种炎症通路特有的基因表达。

样本量估计：研究计划的功效和样本量是固定的，因为在研究窗口期间预期招募到该试验研究的符合条件的患者数量。 根据初步数据和所描述的感染类型定义，研究人员预计在 1 年的招募窗口中，他们将能够招募大约 10 名没有真菌感染的人，10 名有真菌感染但没有 ABPA 的患者和 5 名有 ABPA 的患者. 主要分析计划侧重于表 3 中描述的关键血浆和痰测量的描述和比较。在将控制臂（无真菌感染）与非 ABPA 组或 ABPA 组进行比较时，功率分析提供了可检测的效果大小。 计算基于在 PASS 版本 15 统计软件 (2) 中进行的双侧双样本等方差 t 检验的 80% 功效和 0.05 类型错误率。 当总体效应大小分别为 1.36 和 1.66 时，真菌感染组中 10 和 5 的组样本大小达到 80% 拒绝零效应大小的原假设。 因此，该研究以 80% 的功效检测出待测量的平均标记物的差异大于 1.66 和 1.32 标准差。 鉴于文献中关于 CF 中 Th2 标记的有限数据，我们将这些计算基于与我们正在测试的多个 Th2 标记的平均值的偏差。

数据收集和存储：所有受试者将在研究样本收集时取消识别并使用主密钥存储。 PI 对这些信息的访问权限有限，只有必要的研究人员能够监控和查看数据。 所有硬拷贝源文件都将保存在 CF 研究团队存储设施的上锁文件柜中。 此外，为进一步确保数据完整性，本研究的数据将存储在研究电子数据采集系统 (REDCap) 中，该系统将只允许必要的个人进行有限访问。 REDCap 启用在线验证以最大限度地减少转录错误，并提供数据提交的实时通知，并允许立即进行中央监控和反馈。 访问数据需要加密的安全套接字层 (SSL) 连接，更改按用户 ID、时间戳和项目记录。 数据库经常备份。