Profils immunitaires dans les infections fongiques de la mucoviscidose

Alors que les bactéries sont des agents prédominants dans la maladie pulmonaire FK, les champignons sont souvent isolés à la fois dans les expectorations et dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire (BAL), mais leur rôle dans la FK n'est pas entièrement compris. L'infection fongique dans la mucoviscidose a un large éventail de présentations, allant de la détection transitoire à l'infection persistante, la bronchite fongique aiguë avec exacerbation pulmonaire résultante, la sensibilisation aux allergènes fongiques et l'aspergillose bronchopulmonaire allergique (ABPA). Bien qu'il existe des directives cliniques pour le diagnostic et le traitement de l'ABPA chez les patients atteints de mucoviscidose, il existe peu de directives et de recommandations concernant la surveillance, les soins cliniques et le traitement antifongique dans les diverses présentations de la maladie fongique de la mucoviscidose ; De plus, l'impact clinique des champignons sans ABPA est mal compris. Alors que l'inflammation dans la mucoviscidose est classiquement considérée comme un processus piloté par les neutrophiles et les macrophages (Th1), il a été démontré que les éosinophiles et les cytokines allergiques (Th2) étaient élevés en présence d'une maladie fongique dans les études cliniques et animales sur la mucoviscidose. Des études ont également montré une diminution de la fonction pulmonaire (par ex. pour cent prédit le volume expiratoire forcé en une seconde, ppFEV1) chez les personnes présentant une détection fréquente de champignons dans leurs expectorations, et des associations avec une infection à Pseudomonas et l'utilisation d'antimicrobiens. Les adultes atteints de mucoviscidose sont également plus sujets à la sensibilisation fongique que les patients non fibro-kystiques et présentent des taux plus élevés de rhinite allergique et d'atopie. Dans une étude rétrospective réalisée dans notre centre, nous avons constaté que les enfants atteints d'infections fongiques intermittentes ou chroniques présentaient un déclin plus rapide de la fonction pulmonaire par rapport à ceux sans infections fongiques, quel que soit le statut ABPA (voir les données préliminaires). Comprendre si les infections fongiques sont provoquées par un processus inflammatoire allergique (Th2) peut modifier les approches de traitement en utilisant plus facilement des stéroïdes et des thérapies antifongiques chez les patients atteints d'une infection fongique pour lutter contre le déclin de la fonction pulmonaire. Des études limitées ont étudié la fréquence de la sensibilisation allergique aux agents pathogènes fongiques chez les personnes atteintes de mucoviscidose, la fréquence de la sensibilisation allergique dans la population pédiatrique mucoviscidose en général, et les profils inflammatoires et phénotypes uniques des infections fongiques mucoviscidose, à la fois dans les expectorations et le sérum.

Hypothèse : Nous émettons l'hypothèse que les enfants atteints de mucoviscidose et d'infections fongiques sans ABPA auront des profils inflammatoires allergiques élevés et une sensibilisation accrue aux éléments fongiques par rapport à ceux sans infection fongique.

Objectif spécifique 1 : Comparer l'inflammation Th2 chez les patients avec et sans infections fongiques chez les patients atteints de mucoviscidose et chez ceux atteints d'ABPA.

• Approche : Nous obtiendrons des échantillons de sérum et d'expectoration de 25 patients présentant soit (1) une infection fongique sans ABPA, n = 10 (défini comme ≥ deux cultures fongiques positives au cours des 18 mois précédents), (2) aucune infection fongique, n = 10, et (3) ABPA, n = 5, et mesures spécifiques des expectorations et des cytokines sériques pour évaluer les voies inflammatoires Th2 et Th1.
• Biomarqueurs mesurés : protéine cationique éosinophile (ECP), interleukine-4 (IL4), interleukine-5 (IL5), interleukine-10 (IL10), interleukine-13 (IL13) et nombre d'éosinophiles dans le sérum et les expectorations.
• Résultat attendu : les personnes atteintes d'une infection fongique sans APBA auront des marqueurs Th2 d'inflammation élevés par rapport à celles qui n'ont pas d'infection fongique. Nous comparerons également à ceux avec ABPA en tant que groupe de contrôle séparé. Nous mesurerons également les marqueurs Th1 à utiliser comme référence pour les profils inflammatoires précédemment établis observés dans la mucoviscidose, en voyant si les personnes atteintes d'une maladie fongique dévient vers un processus plus axé sur Th2.

Objectif spécifique 2 : Étudier la sensibilisation allergique aux éléments fongiques chez les patients atteints d'infection fongique CF sans ABPA par rapport à ceux sans infection fongique et à ceux avec ABPA.

• Approche : Nous mesurerons les IgE totales et les tests ImmunoCAP sériques des niveaux d'IgE spécifiques aux protéines fongiques de diverses espèces (Aspergillus, Candida, etc.). pour déterminer la sensibilisation fongique. Nous interrogerons également les patients sur les expositions environnementales afin d'explorer les relations avec la sensibilisation allergique.
• Résultat attendu : les personnes atteintes d'une infection fongique sans ABPA seront plus susceptibles de présenter une sensibilisation allergique aux éléments fongiques par rapport à celles qui n'ont pas d'infection fongique.

Les résultats de cette étude aideront à caractériser le profil inflammatoire associé aux infections fongiques FK, contribuant ainsi à la compréhension de la nature infectieuse et allergique de la maladie dans la population FK. À partir de là, la contribution à la physiopathologie et aux caractéristiques cliniques des infections fongiques de la mucoviscidose servira d'étape vers la compréhension des options de gestion, des directives de soins et de la progression de la maladie pour cet ensemble unique d'organismes difficiles à traiter.

Recrutement : Nous proposons de recruter 25 patients atteints de mucoviscidose âgés de 8 à 25 ans qui acceptent de participer à cette étude transversale portant sur les caractéristiques du système immunitaire de l'infection fongique et de l'ABPA. Nous prévoyons de sélectionner les personnes qui se présentent à leur clinique de routine de FK et de les approcher concernant leur intérêt à participer à cette étude. À partir de là, nous expliquerons le concept, l'hypothèse et les procédures impliquées dans l'intention de les programmer pour une visite de recherche.

Sélection des patients : les patients seront recrutés dans le centre de FK du CHCO par des chercheurs de l'étude ou des coordonnateurs de recherche qualifiés lors d'une visite de routine à la clinique.

Visite d'étude : Nous prévoyons de recruter de manière prospective 25 sujets atteints de mucoviscidose pendant une période de stabilité clinique. Les sujets auront une visite à la clinique de recherche qui coïncidera avec leur visite à la clinique dans les installations de la CHCO Pulmonary Clinic. Les informations de diagnostic suivantes seront saisies sur les formulaires de rapport de cas : informations démographiques, antécédents de diagnostic et mutations, comorbidités liées à la mucoviscidose, résultats de microbiologie historiques, y compris les résultats de culture fongique, les médicaments, y compris la thérapie modulatrice et les régimes antibiotiques à long terme, les tests d'allergie antérieurs, critères de diagnostic de l'ABPA (le cas échéant). Nous utiliserons également les données cliniques historiques du dossier médical pour établir d'autres comorbidités, les tendances de la fonction pulmonaire et la ligne de base, l'historique d'autres infections bactériennes, l'historique des diagnostics d'allergie et d'autres antécédents médicaux et tests de diagnostic pertinents (c. analyses de sang antérieures, etc.). Les évaluations suivantes seront effectuées :

• Données historiques dans le dossier médical. Les exemples incluent les diagnostics de comorbidité liés à la mucoviscidose (tels que, mais sans s'y limiter, le diabète lié à la mucoviscidose, la maladie hépatique de la mucoviscidose, l'asthme, etc.), les analyses de sang antérieures (comme, mais sans s'y limiter, les taux sériques d'IgE, les tests d'allergie antérieurs, les données de bronchoscopie et études de lavage, laboratoires de mucoviscidose de routine et urgents/d'admission, etc.), données antérieures de spirométrie et de fonction pulmonaire, données nutritionnelles et de croissance antérieures (IMC, taux de vitamines, etc.), données antérieures de microbiologie et de culture, etc.
• Mesures de l'IMC obtenues lors d'une visite régulière à la clinique de FK
• Taille et poids à obtenir puis à calculer.
• Tests de la fonction pulmonaire obtenus lors d'une visite régulière à la clinique de FK. La spirométrie sera effectuée selon les critères de l'American Thoracic Society, tandis que les valeurs absolues seront converties en pourcentage prédit à l'aide des équations de référence de l'initiative Global Lung Function34.
• Collecte de crachats. Les expectorations spontanément expectorées seront utilisées dans la mesure du possible. Elles seront recueillies à domicile par le patient après un régime de dégagement des voies respiratoires de routine dans les 12 heures suivant la visite à la clinique. L'échantillon sera placé dans une tasse à spécimen envoyée par la poste et placé sur de la glace et apporté à la visite à la clinique. Si les expectorations ne peuvent pas être expectorées avant la visite, nous essaierons d'utiliser les expectorations restantes qui ne sont pas utilisées pour les besoins cliniques pour une analyse et un stockage plus poussés. Les crachats peuvent être recueillis par induction d'expectorations conformément à la procédure opératoire standard actuelle du réseau de développement thérapeutique CFF si 1) incapable d'expectorer, (2) le patient répond aux critères cliniques d'induction d'expectorations et (3) la clinique est en mesure d'effectuer des expectorations induites par la recherche sur la base des Directives COVID-19 pour assurer la sécurité des membres de l'équipe et un approvisionnement adéquat en EPI.

Pour des raisons de sécurité, les procédures d'induction ne seront réalisées que pour les sujets qui répondent aux critères suivants le jour de l'induction : VEMS ≥ 30 % prévu, Aucun antécédent d'hémoptysie > 5 mL dans les 48 heures précédant la visite, Capable de tolérer la procédure d'induction d'expectoration. Il convient de noter qu'il existe peu de différence significative dans la qualité des échantillons pour l'analyse entre les expectorations et les expectorations induites. Marqueurs à tester comme décrit précédemment ci-dessus.

• Questionnaire d'exposition aux champignons environnementaux. Sera effectué avant la fin de la visite à la clinique. Ce questionnaire dans son intégralité est un questionnaire validé utilisé par le Dr Andy Liu. Compte tenu des contraintes de temps pour les participants à l'étude, nous utilisons un questionnaire modifié axé sur les questions d'intérêt pour cette étude (par ex. concernant l'exposition aux champignons). Cela n'a pas été validé mais peut fournir des informations importantes dans cette étude pilote pour de futures recherches

• Collecte de sérum. Le prélèvement de sang veineux périphérique sera effectué par une personne certifiée utilisant une technique stérile appropriée par le CTRC. Les échantillons seront étiquetés selon les normes du protocole de recherche. Marqueurs à tester décrits ci-dessus.

  • Tous les échantillons d'expectoration doivent être mis en banque et sauvegardés pour une analyse potentielle du microbiome, du mycobiome et du transcriptome, en évaluant les expressions géniques uniques à diverses voies inflammatoires.

Estimations de la taille de l'échantillon : la puissance et la taille de l'échantillon pour la proposition d'étude sont fixées en raison du nombre prévu de patients éligibles à recruter dans cette étude pilote pendant la fenêtre d'étude. Sur la base des données préliminaires et des définitions décrites des types d'infection, les chercheurs prévoient que sur une fenêtre de recrutement d'un an, ils pourront recruter environ 10 personnes sans infection fongique, 10 patients avec une infection fongique mais pas ABPA et 5 avec ABPA . Le plan d'analyse principal se concentre sur la description et la comparaison des mesures clés du plasma et des expectorations décrites dans le tableau 3. L'analyse de puissance fournit les tailles d'effet détectables lors de la comparaison du bras témoin (pas d'infection fongique) au groupe non ABPA ou au groupe ABPA. Les calculs sont basés sur une puissance de 80 % et un taux d'erreur de type I de 0,05 pour le test t bilatéral à variance égale à deux échantillons effectué dans le logiciel statistique PASS version 15 (2). Les tailles d'échantillon de groupe de 10 et 5 dans les groupes d'infection fongique atteignent une puissance de 80 % pour rejeter l'hypothèse nulle de taille d'effet nulle lorsque la taille d'effet de la population est de 1,36 et 1,66 respectivement. Ainsi, l'étude est alimentée à 80% pour détecter une différence des marqueurs moyens à mesurer supérieure à 1,66 et 1,32 écart type. Compte tenu des données limitées dans la littérature concernant les marqueurs Th2 dans la mucoviscidose, nous basons ces calculs sur les écarts par rapport à une moyenne pour les multiples marqueurs Th2 que nous testons.

Collecte et stockage des données : tous les sujets seront anonymisés lors de la collecte des échantillons d'étude et stockés avec une clé principale. Il y aura un accès limité à ces informations avec le PI et uniquement le personnel de recherche essentiel capable de surveiller et de visualiser les données. Tous les documents source sur papier seront conservés dans un classeur verrouillé dans les installations d'entreposage de l'équipe de recherche des FC. De plus, pour garantir davantage l'intégrité des données, les données de cette étude seront stockées dans le système de capture électronique de données de recherche (REDCap), qui permettra un accès limité aux seuls personnels essentiels. REDCap permet une validation en ligne pour minimiser les erreurs de transcription et fournit des notifications en temps réel de la soumission des données et permet une surveillance et une rétroaction centrales immédiates. L'accès aux données nécessite une connexion SSL (Secure Socket Layer) cryptée et les modifications sont enregistrées par ID utilisateur, horodatage et projet. Les bases de données sont fréquemment sauvegardées.