Immunprofiler ved CF-svampeinfektion

Mens bakterier er fremherskende stoffer i CF-lungesygdomme, isoleres svampe ofte i både sputum og bronchoalveolær lavagevæske (BAL), men deres rolle i CF er ikke fuldt ud forstået. Svampeinfektion i CF har et bredt spektrum af præsentationer, varierende fra forbigående påvisning til vedvarende infektion, akut svampebronkitis med deraf følgende pulmonal eksacerbation, sensibilisering over for svampeallergener og allergisk bronkopulmonal aspergillose (ABPA). Mens der er kliniske retningslinjer for diagnosticering og behandling af ABPA hos patienter med CF, er der få retningslinjer og anbefalinger vedrørende monitorering, klinisk pleje og antifungal behandling i de forskellige præsentationer af CF-svampesygdom; desuden er den kliniske virkning af svampe uden ABPA dårligt forstået. Mens inflammation i CF klassisk betragtes som en neutrofil- og makrofagdrevet proces (Th1), har eosinofiler og allergiske cytokiner (Th2) vist sig at være forhøjet ved tilstedeværelse af svampesygdomme i både kliniske og dyre-CF-studier. Undersøgelser har også vist nedsat lungefunktion (f. procent forudsagt forceret udåndingsvolumen på et sekund, ppFEV1) hos personer med hyppig svampepåvisning i deres sputum og associationer til Pseudomonas-infektion og brug af antimikrobielle stoffer. Voksne med CF er også mere tilbøjelige til svampesensibilisering sammenlignet med ikke-CF-patienter samt har højere forekomst af allergisk rhinitis og atopi. I en retrospektiv undersøgelse udført på vores center fandt vi, at børn med intermitterende eller kroniske svampeinfektioner oplevede hurtigere fald i lungefunktionen sammenlignet med dem uden svampeinfektioner uanset ABPA-status (se foreløbige data). Forståelse af, om svampeinfektioner er drevet af en allergisk (Th2) inflammatorisk proces, kan ændre behandlingsmetoder ved at bruge steroider og svampedræbende terapier lettere hos patienter med svampeinfektion for at bekæmpe nedsat lungefunktion. Begrænsede undersøgelser har undersøgt hyppigheden af ​​allergisk sensibilisering over for svampepatogener hos personer med CF, hyppigheden af ​​allergisk sensibilisering i den pædiatriske CF-population generelt og de unikke inflammatoriske profiler og fænotyper af CF-svampeinfektioner, både i sputum og serum.

Hypotese: Vi antager, at børn med CF og svampeinfektioner uden ABPA vil have forhøjede allergiske inflammatoriske profiler og øget sensibilisering over for svampeelementer sammenlignet med dem uden svampeinfektion.

Specifikt mål 1: Sammenlign Th2-inflammation hos patienter med og uden svampeinfektioner hos patienter med CF og med dem med ABPA.

• Fremgangsmåde: Vi vil indhente serum- og sputumprøver fra 25 patienter med enten (1) svampeinfektion uden ABPA, n=10 (defineret som ≥ to positive svampekulturer inden for de foregående 18 måneder), (2) ingen svampeinfektion, n=10, og (3) ABPA, n=5, og mål specifikke sputum- og serumcytokinmålinger for at evaluere Th2- og Th1-inflammatoriske veje.
• Målte biomarkører: Eosinofilt kationisk protein (ECP), Interleukin-4 (IL4), Interleukin-5 (IL5), Interleukin-10 (IL10), Interleukin-13 (IL13) og eosinofiltal i både serum og sputum.
• Forventet resultat: Personer med svampeinfektion uden APBA vil have forhøjede Th2-markører for inflammation sammenlignet med dem uden svampeinfektion. Vi vil også sammenligne med dem med ABPA som en separat kontrolgruppe. Vi vil også måle Th1-markører, der skal bruges som reference til tidligere etablerede inflammatoriske profiler set i CF, for at se om dem med svampesygdom afviger mod en mere Th2-drevet proces.

Specifikt mål 2: Undersøg allergisk sensibilisering over for svampeelementer hos patienter med CF svampeinfektion uden ABPA sammenlignet med dem uden svampeinfektion og til dem med ABPA.

• Fremgangsmåde: Vi vil måle total IgE og serum ImmunoCAP-test af specifikke IgE-niveauer til svampeproteiner af forskellige arter (Aspergillus, Candida osv.). at bestemme svampesensibilisering. Vi vil også undersøge patienter med hensyn til miljøeksponering for at udforske sammenhænge med allergisk sensibilisering.
• Forventet resultat: Personer med svampeinfektion uden ABPA vil være mere tilbøjelige til at vise allergisk sensibilisering over for svampeelementer sammenlignet med dem uden svampeinfektion.

Resultaterne af denne undersøgelse vil hjælpe med at karakterisere den inflammatoriske profil forbundet med CF-svampeinfektioner, hvilket bidrager til forståelsen af ​​både den infektiøse og allergiske karakter af sygdom i CF-populationen. Ud fra dette vil bidraget til både patofysiologien og de kliniske karakteristika af CF-svampeinfektioner tjene som et skridt i retning af at forstå behandlingsmuligheder, retningslinjer for pleje og sygdomsprogression for dette unikke sæt af svære at behandle organismer.

Rekruttering: Vi foreslår at rekruttere 25 patienter med CF i alderen mellem 8 og 25 år, som accepterer at deltage i dette tværsnitsstudie, der ser på immunsystemets karakteristika ved svampeinfektion og ABPA. Vi planlægger at screene personer, der kommer til deres rutinemæssige CF-klinik, og henvende os til dem vedrørende deres interesse for at deltage i denne undersøgelse. Ud fra dette vil vi forklare konceptet, hypotesen og procedurerne involveret med henblik på at planlægge dem til et forskningsbesøg.

Patientvalg: Patienter vil blive rekrutteret fra CF-centret ved CHCO af undersøgelsesforskere eller kvalificerede forskningskoordinatorer på tidspunktet for et rutinemæssigt klinikbesøg.

Studiebesøg: Vi planlægger prospektivt at rekruttere 25 forsøgspersoner med CF i en periode med klinisk stabilitet. Forsøgspersonerne vil have ét forskningsklinikbesøg, der falder sammen med deres klinikbesøg på CHCO Pulmonal Clinic-faciliteter. Følgende diagnostiske oplysninger vil blive indtastet på Case Report Forms: demografiske oplysninger, diagnostisk historie og mutationer, CF-relaterede komorbiditeter, historiske mikrobiologiske resultater, herunder svampekulturresultater, medicin inklusive modulatorterapi og langsigtede antibiotikakure, tidligere allergitests, diagnostiske kriterier for ABPA (hvis relevant). Vi vil også bruge historiske kliniske data fra journalen til at etablere andre følgesygdomme, lungefunktionstendenser og baseline, historie med andre bakterielle infektioner, historie med allergidiagnoser og anden relevant medicinsk historie og diagnostiske tests (dvs. tidligere CT-scanningsresultater, tidligere blodprøver osv.). Følgende evalueringer vil blive udført:

• Historiske data i journalen. Eksempler omfatter komorbide diagnoser relateret til CF (såsom, men ikke begrænset til CF-relateret diabetes, CF-leversygdom, astma osv.), tidligere blodprøver (såsom, men ikke begrænset til serum-IgE-niveauer, tidligere allergitest, bronkoskopidata og skylleundersøgelser, rutine- og akutte/indlæggelses-CF-laboratorier osv.), tidligere spirometer- og lungefunktionsdata, tidligere ernærings- og vækstdata (BMI, vitaminniveauer osv.), tidligere mikrobiologi- og kulturdata osv.
• BMI-målinger opnået fra almindelige CF-klinikbesøg
• Højde og vægt skal indhentes og efterfølgende beregnes.
• Lungefunktionstest opnået fra regelmæssigt CF-klinikbesøg. Spirometri vil blive udført i henhold til American Thoracic Society-kriterier, mens absolutte værdier vil blive konverteret til procent forudsagt ved hjælp af Global Lung Function-initiativets referenceligninger34.
• Sputum samling. Spontant ekspektoreret opspyt vil blive brugt som muligt. Dette vil blive opsamlet hjemme af patienten efter en rutinemæssig luftvejsrensning inden for 12 timer efter klinikbesøget. Prøven anbringes i en prøvekop med posten og placeres på is og bringes til klinikbesøget. Hvis opspyt ikke er i stand til at blive ekspektoreret inden besøget, vil vi forsøge at udnytte resterende opspyt, som ikke bruges til kliniske behov til yderligere analyse og opbevaring. Sputum kan opsamles ved sputuminduktion i henhold til den nuværende CFF Therapeutics Development Network standard operationsprocedure, hvis 1) ikke er i stand til at ekspektorere, (2) patienten opfylder kliniske kriterier for sputuminduktion og (3) klinikken er i stand til at udføre forskningsinduceret sputum baseret på nuværende COVID-19-retningslinjer for at sikre teammedlemmernes sikkerhed og tilstrækkelige PPE-forsyninger.

Af sikkerhedsmæssige årsager vil induktionsprocedurerne kun blive udført for forsøgspersoner, der opfylder følgende kriterier på dagen for induktionen: FEV1 ≥ 30 % forudsagt, ingen historie med > 5 ml hæmoptyse inden for 48 timer før besøget, i stand til at tolerere sputuminduktionsprocedure. Det skal bemærkes, at der er lille signifikant forskel i prøvekvaliteten til analyse mellem opspyt og induceret opspyt. Markører, der skal testes som tidligere beskrevet ovenfor.

• Spørgeskema for miljømæssig svampeeksponering. Vil blive udført inden afslutning af klinikbesøg. Hele dette spørgeskema er et valideret spørgeskema brugt af Dr. Andy Liu. I betragtning af tidsbegrænsninger for undersøgelsesdeltagere bruger vi et modificeret spørgeskema, der fokuserer på spørgsmål af interesse for denne undersøgelse (f. vedrørende svampeeksponering). Dette er ikke blevet valideret, men kan give vigtig information i denne pilotundersøgelse til fremtidig forskning

• Serum samling. Perifer venøs blodudtagning vil blive udført af certificeret person ved hjælp af passende steril teknik af CTRC. Prøver vil blive mærket efter forskningsprotokolstandarder. Markører, der skal testes, beskrevet ovenfor.

  • Alle sputumprøver skal samles og gemmes til potentiel mikrobiom-, mycobiom- og transkriptomanalyse, vurderende genudtryk, der er unikke for forskellige inflammatoriske veje.

Prøvestørrelsesestimater: Effekt og stikprøvestørrelse for undersøgelsesforslaget er fastsat på grund af det forventede antal kvalificerede patienter, der skal rekrutteres til denne pilotundersøgelse i løbet af undersøgelsesvinduet. Baseret på foreløbige data og de beskrevne definitioner af infektionstyper, forventer efterforskerne, at de over et 1-årigt rekrutteringsvindue vil være i stand til at indskrive ca. 10 personer uden svampeinfektion, 10 patienter med en svampeinfektion, men ikke ABPA og 5 med ABPA . Den primære analyseplan fokuserer på beskrivelsen og sammenligningen af ​​centrale plasma- og sputummål beskrevet i tabel 3. Effektanalyse giver de påviselige effektstørrelser, når man sammenligner kontrolarmen (ingen svampeinfektion) med enten ikke-ABPA-gruppen eller ABPA-gruppen. Beregninger er baseret på en potens på 80 % og Type I fejlrate på 0,05 for tosidet to-sample lige-varians t-test udført i PASS version 15 statistisk software (2). Gruppeprøvestørrelser på 10 og 5 i svampeinfektionsgrupperne opnår 80 % magt til at forkaste nulhypotesen om nul effektstørrelse, når populationseffektstørrelsen er henholdsvis 1,36 og 1,66. Undersøgelsen er således drevet af 80 % til at detektere en forskel i de gennemsnitlige markører, der skal måles, større end 1,66 og 1,32 standardafvigelser. Givet begrænsede data i litteraturen vedrørende Th2-markører i CF, baserer vi disse beregninger ud fra afvigelser fra et gennemsnit for de multiple Th2-markører, vi tester.

Dataindsamling og lagring: Alle forsøgspersoner vil blive afidentificeret ved indsamling af undersøgelsesprøver og gemt med en hovednøgle. Der vil være begrænset adgang til disse oplysninger med PI og kun væsentligt forskningspersonale, der kan overvåge og se dataene. Alle trykte kildedokumenter vil blive opbevaret i et aflåst arkivskab i CF-forskerteamets lagerfaciliteter. For yderligere at sikre dataintegritet vil data til denne undersøgelse blive lagret i Research Electronic Data Capture-systemet (REDCap), som vil tillade begrænset adgang til kun væsentlige personlige. REDCap muliggør in-line validering for at minimere transskriptionsfejl og giver realtidsmeddelelser om dataindsendelse og muliggør øjeblikkelig central overvågning og feedback. Adgang til data kræver en krypteret SSL-forbindelse (Secure Socket Layer), og ændringer logges af bruger-id, tidsstempel og projekt. Databaser sikkerhedskopieres ofte.