Perfiles inmunológicos en la infección por hongos en la FQ

Si bien las bacterias son los agentes predominantes en la enfermedad pulmonar de la FQ, los hongos a menudo se aíslan tanto en el esputo como en el líquido de lavado broncoalveolar (BAL), aunque su papel en la FQ no se comprende completamente. La infección fúngica en la FQ tiene un amplio espectro de presentaciones, que van desde la detección transitoria hasta la infección persistente, bronquitis fúngica aguda con exacerbación pulmonar resultante, sensibilización a alérgenos fúngicos y aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA). Si bien existen guías clínicas para el diagnóstico y tratamiento de la ABPA en pacientes con FQ, existen pocas guías y recomendaciones sobre el control, la atención clínica y el tratamiento antimicótico en las diversas presentaciones de la enfermedad fúngica de la FQ; además, el impacto clínico de los hongos sin ABPA es poco conocido. Si bien la inflamación en la FQ se considera clásicamente un proceso impulsado por neutrófilos y macrófagos (Th1), se ha demostrado que los eosinófilos y las citoquinas alérgicas (Th2) están elevados en presencia de enfermedad fúngica en estudios de FQ clínicos y en animales. Los estudios también han demostrado una disminución de la función pulmonar (p. porcentaje predicho del volumen espiratorio forzado en un segundo, ppFEV1) en individuos con detección frecuente de hongos en su esputo, y asociaciones con infección por Pseudomonas y uso de antimicrobianos. Los adultos con FQ también son más propensos a la sensibilización fúngica en comparación con los pacientes sin FQ, además de tener tasas más altas de rinitis alérgica y atopia. En un estudio retrospectivo realizado en nuestro centro, encontramos que los niños con infecciones fúngicas intermitentes o crónicas experimentaron una disminución más rápida de la función pulmonar en comparación con aquellos sin infecciones fúngicas, independientemente del estado ABPA (consulte los datos preliminares). Comprender si las infecciones fúngicas son impulsadas por un proceso inflamatorio alérgico (Th2) puede alterar los enfoques de tratamiento al utilizar esteroides y terapias antifúngicas más fácilmente en pacientes con infección fúngica para combatir la disminución de la función pulmonar. Estudios limitados han investigado la frecuencia de sensibilización alérgica a patógenos fúngicos en personas con FQ, la frecuencia de sensibilización alérgica en la población pediátrica con FQ en general y los perfiles inflamatorios y fenotipos únicos de las infecciones fúngicas en FQ, tanto en el esputo como en el suero.

Hipótesis: Nuestra hipótesis es que los niños con FQ e infecciones fúngicas sin ABPA tendrán perfiles alérgicos inflamatorios elevados y una mayor sensibilización a elementos fúngicos en comparación con aquellos sin infección fúngica.

Objetivo específico 1: comparar la inflamación Th2 en pacientes con y sin infecciones fúngicas en pacientes con FQ y pacientes con ABPA.

• Enfoque: Obtendremos muestras de suero y esputo de 25 pacientes con (1) infección fúngica sin ABPA, n=10 (definida como ≥ dos cultivos fúngicos positivos en los 18 meses anteriores), (2) sin infección fúngica, n=10, y (3) ABPA, n = 5, y miden mediciones específicas de citoquinas en esputo y suero para evaluar las vías inflamatorias Th2 y Th1.
• Biomarcadores medidos: proteína catiónica eosinofílica (ECP), interleucina-4 (IL4), interleucina-5 (IL5), interleucina-10 (IL10), interleucina-13 (IL13) y recuento de eosinófilos tanto en suero como en esputo.
• Resultado esperado: las personas con infección fúngica sin APBA tendrán marcadores de inflamación Th2 elevados en comparación con las personas sin infección fúngica. También compararemos con aquellos con ABPA como un grupo de control separado. También mediremos los marcadores Th1 que se utilizarán como referencia para los perfiles inflamatorios previamente establecidos que se observan en la FQ, para ver si aquellos con enfermedades fúngicas se desvían hacia un proceso más impulsado por Th2.

Objetivo específico 2: Investigar la sensibilización alérgica a elementos fúngicos en pacientes con infección fúngica FQ sin ABPA en comparación con aquellos sin infección fúngica y con ABPA.

• Enfoque: Mediremos la IgE total y la prueba ImmunoCAP en suero de los niveles de IgE específicos para proteínas fúngicas de varias especies (Aspergillus, Candida, etc.). para determinar la sensibilización fúngica. También encuestaremos a los pacientes sobre exposiciones ambientales para explorar las relaciones con la sensibilización alérgica.
• Resultado esperado: las personas con infección fúngica sin ABPA tendrán más probabilidades de mostrar sensibilización alérgica a los elementos fúngicos en comparación con las personas sin infección fúngica.

Los resultados de este estudio ayudarán a caracterizar el perfil inflamatorio asociado con las infecciones fúngicas de la FQ, contribuyendo a la comprensión de la naturaleza tanto infecciosa como alérgica de la enfermedad en la población con FQ. A partir de esto, la contribución tanto a la fisiopatología como a las características clínicas de las infecciones fúngicas de la FQ servirá como un paso hacia la comprensión de las opciones de manejo, las pautas de atención y la progresión de la enfermedad para este conjunto único de organismos difíciles de tratar.

Reclutamiento: Proponemos reclutar a 25 pacientes con FQ de edades comprendidas entre los 8 y los 25 años que acepten participar en este estudio transversal que analiza las características del sistema inmunitario de la infección por hongos y la ABPA. Planeamos evaluar a las personas que acuden a su clínica de FQ de rutina y acercarnos a ellas con respecto a su interés en participar en este estudio. A partir de esto, explicaremos el concepto, la hipótesis y los procedimientos involucrados con la intención de programarlos para una visita de investigación.

Selección de pacientes: los investigadores del estudio o los coordinadores de investigación calificados reclutarán a los pacientes del Centro de FQ en CHCO en el momento de una visita clínica de rutina.

Visita de estudio: Planeamos reclutar prospectivamente a 25 sujetos con FQ durante un período de estabilidad clínica. Los sujetos tendrán una visita a la clínica de investigación que coincidirá con su visita a la clínica en las instalaciones de la Clínica Pulmonar de CHCO. La siguiente información de diagnóstico se ingresará en los formularios de informes de casos: información demográfica, antecedentes de diagnóstico y mutaciones, comorbilidades relacionadas con la FQ, resultados históricos de microbiología, incluidos los resultados de cultivos de hongos, medicamentos que incluyen terapia moduladora y regímenes de antibióticos a largo plazo, pruebas de alergia anteriores, criterios de diagnóstico para ABPA (si corresponde). También utilizaremos datos clínicos históricos del registro médico para establecer otras comorbilidades, tendencias de la función pulmonar y línea de base, antecedentes de otras infecciones bacterianas, antecedentes de diagnósticos de alergias y otros antecedentes médicos pertinentes y pruebas de diagnóstico (es decir, resultados de tomografías computarizadas anteriores, análisis de sangre previos, etc.). Se realizarán las siguientes evaluaciones:

• Datos históricos en la historia clínica. Los ejemplos incluyen diagnósticos de comorbilidad relacionados con la FQ (como, entre otros, diabetes relacionada con la FQ, enfermedad hepática con FQ, asma, etc.), análisis de sangre previos (como, entre otros, niveles séricos de IgE, pruebas de alergia previas, datos de broncoscopia y estudios de lavado, laboratorios de FQ de rutina y urgentes/ingresos, etc.), datos previos de espirometría y función pulmonar, datos previos nutricionales y de crecimiento (IMC, niveles de vitaminas, etc.), datos previos de microbiología y cultivos, etc.
• Mediciones de IMC obtenidas de una visita clínica regular de FQ
• Altura y peso a obtener y posteriormente calculados.
• Pruebas de función pulmonar obtenidas de una visita clínica regular de FQ. La espirometría se realizará de acuerdo con los criterios de la Sociedad Torácica Estadounidense, mientras que los valores absolutos se convertirán al porcentaje previsto utilizando las ecuaciones de referencia de la iniciativa Global Lung Function34.
• colección de esputo. En la medida de lo posible, se utilizará esputo expectorado espontáneamente. El paciente lo recogerá en casa siguiendo un régimen de limpieza de las vías respiratorias de rutina dentro de las 12 horas posteriores a la visita a la clínica. La muestra se colocará en un recipiente para muestras enviado por correo, se colocará en hielo y se llevará a la visita a la clínica. Si no se puede expectorar el esputo antes de la visita, intentaremos utilizar el esputo restante que no se usa para necesidades clínicas para análisis y almacenamiento adicionales. El esputo se puede recolectar mediante inducción de esputo de acuerdo con el procedimiento operativo estándar actual de la Red de Desarrollo Terapéutico de CFF si 1) no puede expectorar, (2) el paciente cumple con los criterios clínicos para la inducción de esputo y (3) la clínica puede realizar investigación de esputo inducido basado en Pautas de COVID-19 para garantizar la seguridad de los miembros del equipo y el suministro adecuado de EPP.

Por motivos de seguridad, los procedimientos de inducción solo se realizarán en sujetos que cumplan los siguientes criterios el día de la inducción: FEV1 ≥ 30 % del teórico, sin antecedentes de hemoptisis > 5 ml en las 48 horas previas a la visita, capaces de tolerar el procedimiento de inducción de esputo. Es de destacar que hay poca diferencia significativa en la calidad de la muestra para el análisis entre el esputo expectorado y el inducido. Marcadores a ensayar como se ha descrito anteriormente.

• Cuestionario de exposición ambiental a hongos. Se realizará antes de finalizar la visita a la clínica. Este cuestionario en su totalidad es un cuestionario validado utilizado por el Dr. Andy Liu. Dadas las limitaciones de tiempo para los participantes del estudio, estamos utilizando un cuestionario modificado centrado en preguntas de interés para este estudio (p. relacionado con la exposición a hongos). Esto no ha sido validado, pero puede proporcionar información importante en este estudio piloto para futuras investigaciones.

• colección de suero. La extracción de sangre venosa periférica será realizada por una persona certificada utilizando una técnica estéril adecuada por el CTRC. Las muestras se etiquetarán según los estándares del protocolo de investigación. Marcadores a ensayar descritos anteriormente.

  • Todas las muestras de esputo se almacenarán y guardarán para el posible análisis de microbioma, micobioma y transcriptoma, evaluando las expresiones génicas exclusivas de varias vías inflamatorias.

Estimaciones del tamaño de la muestra: la potencia y el tamaño de la muestra para la propuesta de estudio se fijan debido a la cantidad esperada de pacientes elegibles que se reclutarán en este estudio piloto durante la ventana del estudio. Sobre la base de los datos preliminares y las definiciones descritas de los tipos de infección, los investigadores anticipan que durante un período de reclutamiento de 1 año podrán inscribir aproximadamente a 10 personas sin infección por hongos, 10 pacientes con infección por hongos pero sin ABPA y 5 con ABPA. . El plan de análisis principal se centra en la descripción y comparación de las medidas clave de plasma y esputo descritas en la Tabla 3. El análisis de poder proporciona los tamaños de efectos detectables al comparar el brazo de control (sin infección fúngica) con el grupo sin ABPA o con el grupo ABPA. Los cálculos se basan en una potencia del 80 % y una tasa de error de tipo I de 0,05 para la prueba t bilateral de dos muestras de igual varianza realizada en el software estadístico PASS versión 15 (2). Los tamaños de muestra de grupo de 10 y 5 en los grupos de infección fúngica alcanzan un poder del 80 % para rechazar la hipótesis nula del tamaño del efecto cero cuando el tamaño del efecto de la población es 1,36 y 1,66 respectivamente. Por lo tanto, el estudio tiene una potencia del 80 % para detectar una diferencia en los marcadores medios a medir superior a 1,66 y 1,32 desviaciones estándar. Dados los datos limitados en la literatura sobre los marcadores Th2 en la FQ, basamos estos cálculos en desviaciones de una media para los múltiples marcadores Th2 que estamos probando.

Recopilación y almacenamiento de datos: todos los sujetos serán desidentificados tras la recopilación de muestras del estudio y se almacenarán con una clave maestra. Habrá acceso limitado a esta información con el PI y solo el personal de investigación esencial podrá monitorear y ver los datos. Todos los documentos de origen impresos se mantendrán en un archivador cerrado con llave en las instalaciones de almacenamiento del equipo de investigación de CF. Además, para garantizar aún más la integridad de los datos, los datos de este estudio se almacenarán en el sistema de captura de datos electrónicos de investigación (REDCap), que permitirá el acceso limitado solo al personal esencial. REDCap permite la validación en línea para minimizar los errores de transcripción y proporciona notificaciones en tiempo real del envío de datos y permite el monitoreo y la retroalimentación central inmediata. El acceso a los datos requiere una conexión cifrada de capa de conexión segura (SSL) y los cambios se registran por ID de usuario, marca de tiempo y proyecto. Las bases de datos se respaldan con frecuencia.