Immunprofile bei CF-Pilzinfektion

Während Bakterien die vorherrschenden Erreger bei CF-Lungenerkrankungen sind, werden Pilze häufig sowohl im Sputum als auch in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BAL) isoliert, ihre Rolle bei CF ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. Pilzinfektionen bei CF haben ein breites Spektrum an Erscheinungsformen, die von vorübergehender Erkennung bis hin zu persistierender Infektion, akuter Pilzbronchitis mit resultierender Lungenexazerbation, Sensibilisierung gegenüber Pilzallergenen und allergischer bronchopulmonaler Aspergillose (ABPA) reichen. Während es klinische Richtlinien für die Diagnose und Behandlung von ABPA bei Patienten mit CF gibt, gibt es nur wenige Richtlinien und Empfehlungen zur Überwachung, klinischen Versorgung und antimykotischen Behandlung bei den verschiedenen Präsentationen der CF-Pilzerkrankung; Darüber hinaus ist die klinische Wirkung von Pilzen ohne ABPA kaum bekannt. Während die Entzündung bei CF klassischerweise als ein von Neutrophilen und Makrophagen gesteuerter Prozess (Th1) angesehen wird, wurde in klinischen und Tier-CF-Studien gezeigt, dass Eosinophile und allergische Zytokine (Th2) in Gegenwart einer Pilzerkrankung erhöht sind. Studien haben auch eine verminderte Lungenfunktion gezeigt (z. Prozent vorhergesagtes forciertes Ausatmungsvolumen in einer Sekunde, ppFEV1) bei Personen mit häufigem Pilznachweis in ihrem Sputum und Assoziationen mit Pseudomonas-Infektion und Verwendung von Antibiotika. Erwachsene mit CF sind im Vergleich zu Nicht-CF-Patienten auch anfälliger für Pilzsensibilisierung und haben höhere Raten von allergischer Rhinitis und Atopie. In einer an unserem Zentrum durchgeführten retrospektiven Studie fanden wir heraus, dass Kinder mit intermittierenden oder chronischen Pilzinfektionen unabhängig vom ABPA-Status einen schnelleren Rückgang der Lungenfunktion im Vergleich zu Kindern ohne Pilzinfektionen erfuhren (siehe vorläufige Daten). Das Verständnis, ob Pilzinfektionen durch einen allergischen (Th2) Entzündungsprozess ausgelöst werden, kann die Behandlungsansätze ändern, indem bei Patienten mit Pilzinfektionen Steroide und Antimykotika leichter eingesetzt werden, um den Rückgang der Lungenfunktion zu bekämpfen. Begrenzte Studien haben die Häufigkeit allergischer Sensibilisierungen gegen Pilzpathogene bei Personen mit CF, die Häufigkeit allergischer Sensibilisierungen in der pädiatrischen CF-Population im Allgemeinen und die einzigartigen entzündlichen Profile und Phänotypen von CF-Pilzinfektionen sowohl im Sputum als auch im Serum untersucht.

Hypothese: Wir gehen davon aus, dass Kinder mit CF und Pilzinfektionen ohne ABPA im Vergleich zu Kindern ohne Pilzinfektion erhöhte allergische Entzündungsprofile und eine erhöhte Sensibilisierung gegenüber Pilzelementen aufweisen.

Spezifisches Ziel 1: Vergleich der Th2-Entzündung bei Patienten mit und ohne Pilzinfektionen bei Patienten mit CF und Patienten mit ABPA.

• Ansatz: Wir werden Serum- und Sputumproben von 25 Patienten mit entweder (1) Pilzinfektion ohne ABPA, n = 10 (definiert als ≥ zwei positive Pilzkulturen in den letzten 18 Monaten), (2) keine Pilzinfektion, n = 10, und (3) ABPA, n = 5, und Messung spezifischer Sputum- und Serum-Zytokin-Messungen zur Bewertung der Th2- und Th1-Entzündungswege.
• Gemessene Biomarker: Eosinophiles kationisches Protein (ECP), Interleukin-4 (IL4), Interleukin-5 (IL5), Interleukin-10 (IL10), Interleukin-13 (IL13) und Eosinophilenzahl sowohl im Serum als auch im Sputum.
• Erwartetes Ergebnis: Personen mit einer Pilzinfektion ohne APBA weisen im Vergleich zu Personen ohne Pilzinfektion erhöhte Th2-Entzündungsmarker auf. Wir werden auch mit denen mit ABPA als separater Kontrollgruppe vergleichen. Wir werden auch Th1-Marker messen, die als Referenz für zuvor etablierte Entzündungsprofile bei CF verwendet werden sollen, um zu sehen, ob diejenigen mit Pilzerkrankungen zu einem stärker von Th2 angetriebenen Prozess abweichen.

Spezifisches Ziel 2: Untersuchung der allergischen Sensibilisierung gegenüber Pilzelementen bei Patienten mit CF-Pilzinfektion ohne ABPA im Vergleich zu Patienten ohne Pilzinfektion und zu Patienten mit ABPA.

• Ansatz: Wir messen Gesamt-IgE und Serum-ImmunoCAP-Tests spezifischer IgE-Spiegel gegen Pilzproteine ​​verschiedener Arten (Aspergillus, Candida usw.). um eine Pilzsensibilisierung festzustellen. Wir werden auch Patienten zu Umweltbelastungen befragen, um Zusammenhänge mit allergischer Sensibilisierung zu untersuchen.
• Erwartetes Ergebnis: Personen mit einer Pilzinfektion ohne ABPA zeigen mit größerer Wahrscheinlichkeit eine allergische Sensibilisierung gegenüber Pilzelementen im Vergleich zu Personen ohne Pilzinfektion.

Die Ergebnisse dieser Studie werden dazu beitragen, das mit CF-Pilzinfektionen verbundene Entzündungsprofil zu charakterisieren und zum Verständnis sowohl der infektiösen als auch der allergischen Natur der Krankheit in der CF-Population beitragen. Der Beitrag sowohl zur Pathophysiologie als auch zu den klinischen Merkmalen von CF-Pilzinfektionen wird als Schritt zum Verständnis von Behandlungsoptionen, Pflegerichtlinien und Krankheitsverläufen für diese einzigartige Gruppe schwer zu behandelnder Organismen dienen.

Rekrutierung: Wir schlagen vor, 25 Patienten mit CF im Alter zwischen 8 und 25 Jahren zu rekrutieren, die sich bereit erklären, an dieser Querschnittsstudie teilzunehmen, die die Eigenschaften des Immunsystems von Pilzinfektionen und ABPA untersucht. Wir planen, Personen, die in ihre routinemäßige CF-Klinik kommen, zu untersuchen und sie bezüglich ihres Interesses an der Teilnahme an dieser Studie anzusprechen. Daraus werden wir das Konzept, die Hypothese und die Verfahren erklären, die mit der Absicht verbunden sind, sie für einen Forschungsbesuch einzuplanen.

Patientenauswahl: Die Patienten werden zum Zeitpunkt eines Routinebesuchs in der Klinik von Studienprüfern oder qualifizierten Forschungskoordinatoren aus dem CF-Zentrum des CHCO rekrutiert.

Studienbesuch: Wir planen die prospektive Rekrutierung von 25 Probanden mit CF während einer Phase klinischer Stabilität. Die Probanden haben einen Forschungsklinikbesuch, der mit ihrem Klinikbesuch in den Einrichtungen der CHCO Pulmonary Clinic zusammenfällt. Die folgenden diagnostischen Informationen werden in die Fallberichtsformulare eingetragen: demografische Informationen, diagnostische Vorgeschichte und Mutationen, CF-bezogene Komorbiditäten, historische mikrobiologische Ergebnisse, einschließlich Pilzkulturergebnisse, Medikamente, einschließlich Modulatortherapie und langfristige Antibiotikabehandlungen, frühere Allergietests, diagnostische Kriterien für ABPA (falls zutreffend). Wir werden auch historische klinische Daten aus der Krankenakte verwenden, um andere Komorbiditäten, Lungenfunktionstrends und Ausgangswerte, Vorgeschichte anderer bakterieller Infektionen, Vorgeschichte von Allergiediagnosen und andere relevante Anamnese und diagnostische Tests (z. B. frühere CT-Scan-Ergebnisse, frühere Blutuntersuchungen usw.). Folgende Auswertungen werden durchgeführt:

• Historische Daten in der Krankenakte. Beispiele umfassen komorbide Diagnosen im Zusammenhang mit CF (wie, aber nicht beschränkt auf CF-bedingten Diabetes, CF-Lebererkrankung, Asthma usw.), frühere Blutuntersuchungen (wie, aber nicht beschränkt auf Serum-IgE-Spiegel, frühere Allergietests, Bronchoskopiedaten und Lavage-Studien, Routine- und Notfall-/Einweisungs-CF-Labore usw.), frühere Spirometer- und Lungenfunktionsdaten, frühere Ernährungs- und Wachstumsdaten (BMI, Vitaminspiegel usw.), frühere Mikrobiologie- und Kulturdaten usw.
• BMI-Messungen, die bei einem regelmäßigen Besuch in einer CF-Klinik erhalten wurden
• Größe und Gewicht sind zu ermitteln und anschließend zu berechnen.
• Lungenfunktionstests, die bei einem regelmäßigen Besuch in einer CF-Klinik durchgeführt wurden. Die Spirometrie wird gemäß den Kriterien der American Thoracic Society durchgeführt, während die absoluten Werte unter Verwendung der Referenzgleichungen der Global Lung Function-Initiative in vorhergesagte Prozentsätze umgewandelt werden34.
• Sputum-Sammlung. Spontan ausgespucktes Sputum wird nach Möglichkeit verwendet. Dieses wird vom Patienten nach einem routinemäßigen Atemwegsreinigungsprogramm innerhalb von 12 Stunden nach dem Klinikbesuch zu Hause gesammelt. Die Probe wird in einen per Post zugesandten Probenbecher gegeben und auf Eis gelegt und zum Klinikbesuch gebracht. Wenn das Sputum vor dem Besuch nicht ausgespuckt werden kann, werden wir versuchen, das restliche ausgespuckte Sputum, das nicht für klinische Zwecke verwendet wird, zur weiteren Analyse und Lagerung zu verwenden. Sputum kann durch Sputuminduktion gemäß dem aktuellen Standardarbeitsverfahren des CFF Therapeutics Development Network gesammelt werden, wenn 1) kein Auswurf möglich ist, (2) der Patient die klinischen Kriterien für eine Sputuminduktion erfüllt und (3) die Klinik in der Lage ist, forschungsinduziertes Sputum basierend auf dem Strom durchzuführen COVID-19-Richtlinien zur Gewährleistung der Sicherheit des Teammitglieds und einer angemessenen PSA-Versorgung.

Aus Sicherheitsgründen werden die Induktionsverfahren nur bei Probanden durchgeführt, die am Tag der Induktion die folgenden Kriterien erfüllen: FEV1 ≥ 30 % vorhergesagt, keine Vorgeschichte von > 5 ml Hämoptyse innerhalb von 48 Stunden vor dem Besuch, in der Lage, dies zu tolerieren Sputum-Induktionsverfahren. Bemerkenswert ist, dass es kaum einen signifikanten Unterschied in der Probenqualität für die Analyse zwischen expektoriertem und induziertem Sputum gibt. Zu testende Marker wie oben beschrieben.

• Fragebogen zur Exposition gegenüber Pilzen in der Umwelt. Wird vor Ende des Klinikbesuchs durchgeführt. Dieser Fragebogen ist insgesamt ein validierter Fragebogen, der von Dr. Andy Liu verwendet wird. Angesichts der Zeitbeschränkungen für die Studienteilnehmer verwenden wir einen modifizierten Fragebogen, der sich auf Fragen konzentriert, die für diese Studie von Interesse sind (z. bezüglich Pilzexposition). Dies wurde nicht validiert, kann aber in dieser Pilotstudie wichtige Informationen für die zukünftige Forschung liefern

• Serumsammlung. Die periphere venöse Blutentnahme wird von einer zertifizierten Person unter Verwendung einer geeigneten sterilen Technik durch das CTRC durchgeführt. Die Proben werden gemäß den Standards des Forschungsprotokolls gekennzeichnet. Zu testende Marker wie oben beschrieben.

  • Alle Sputumproben werden in einer Bank aufbewahrt und für potenzielle Mikrobiom-, Mykobiom- und Transkriptomanalysen aufbewahrt, wobei die für verschiedene Entzündungswege einzigartigen Genexpressionen bewertet werden.

Schätzungen der Stichprobengröße: Power und Stichprobengröße für den Studienvorschlag sind aufgrund der erwarteten Anzahl geeigneter Patienten festgelegt, die während des Studienfensters für diese Pilotstudie rekrutiert werden sollen. Basierend auf vorläufigen Daten und den beschriebenen Definitionen von Infektionsarten gehen die Forscher davon aus, dass sie über ein Rekrutierungsfenster von 1 Jahr ungefähr 10 Personen ohne Pilzinfektion, 10 Patienten mit einer Pilzinfektion, aber ohne ABPA und 5 mit ABPA aufnehmen können . Der primäre Analyseplan konzentriert sich auf die Beschreibung und den Vergleich der wichtigsten Plasma- und Sputummessungen, die in Tabelle 3 beschrieben sind. Die Power-Analyse liefert die nachweisbaren Effektstärken beim Vergleich des Kontrollarms (keine Pilzinfektion) entweder mit der Nicht-ABPA-Gruppe oder der ABPA-Gruppe. Die Berechnungen basieren auf einer Trennschärfe von 80 % und einer Fehlerquote 1. Art von 0,05 für den zweiseitigen t-Test mit gleicher Varianz bei zwei Stichproben, der in der statistischen Software PASS, Version 15, durchgeführt wurde (2). Gruppenstichprobengrößen von 10 und 5 in den Pilzinfektionsgruppen erreichen eine Power von 80 %, um die Nullhypothese einer Effektgröße von Null abzulehnen, wenn die Populationseffektgröße 1,36 bzw. 1,66 beträgt. Somit ist die Studie mit 80 % Power ausgestattet, um einen Unterschied in den zu messenden mittleren Markern von mehr als 1,66 und 1,32 Standardabweichungen zu erkennen. Angesichts begrenzter Daten in der Literatur zu Th2-Markern bei CF stützen wir diese Berechnungen auf Abweichungen von einem Mittelwert für die mehreren Th2-Marker, die wir testen.

Datenerhebung und -speicherung: Alle Probanden werden bei der Probenentnahme der Studie anonymisiert und mit einem Hauptschlüssel gespeichert. Der Zugriff auf diese Informationen durch den PI ist eingeschränkt, und nur wichtiges Forschungspersonal kann die Daten überwachen und anzeigen. Alle gedruckten Quelldokumente werden in einem verschlossenen Aktenschrank in den Lagereinrichtungen des CF-Forschungsteams aufbewahrt. Um die Datenintegrität weiter zu gewährleisten, werden die Daten für diese Studie außerdem im Research Electronic Data Capture System (REDCap) gespeichert, das nur eingeschränkten Zugriff auf wesentliche personenbezogene Daten ermöglicht. REDCap ermöglicht die Inline-Validierung zur Minimierung von Übertragungsfehlern und bietet Echtzeit-Benachrichtigungen über die Datenübermittlung und ermöglicht eine sofortige zentrale Überwachung und Rückmeldung. Der Zugriff auf Daten erfordert eine verschlüsselte SSL-Verbindung (Secure Socket Layer) und Änderungen werden nach Benutzer-ID, Zeitstempel und Projekt protokolliert. Datenbanken werden regelmäßig gesichert.