Immunprofilok CF gombás fertőzésben

Míg a baktériumok domináns ágensek a CF tüdőbetegségben, a gombákat gyakran izolálják a köpetben és a bronchoalveoláris mosófolyadékban (BAL), de szerepük a CF-ben nem teljesen ismert. A CF-ben a gombás fertőzés a megnyilvánulások széles spektrumával rendelkezik, az átmeneti észleléstől a perzisztáló fertőzésig, az akut gombás hörghurutig és ennek következtében a tüdő exacerbációjáig, a gombás allergénekkel szembeni érzékenységig és az allergiás bronchopulmonalis aspergillosisig (ABPA). Bár léteznek klinikai irányelvek az ABPA diagnosztizálására és kezelésére CF-ben szenvedő betegeknél, kevés iránymutatás és ajánlás létezik a CF gombás betegség különböző megjelenési formáiban a megfigyelésre, a klinikai ellátásra és a gombaellenes kezelésre vonatkozóan; továbbá az ABPA nélküli gombák klinikai hatásai kevéssé ismertek. Míg a CF-ben a gyulladást klasszikusan neutrofil és makrofágok által vezérelt folyamatnak (Th1) tekintik, addig az eozinofilek és az allergiás citokinek (Th2) szintjét mind klinikai, mind állati CF-vizsgálatokban kimutatták gombás betegség jelenlétében. A tanulmányok csökkent tüdőfunkciót is kimutattak (pl. százalékos előrejelzett kényszerített kilégzési térfogat egy másodperc alatt, ppFEV1) azoknál az egyéneknél, akiknél gyakori a gomba kimutatása a köpetükben, és összefüggés van a Pseudomonas fertőzéssel és az antimikrobiális szerek használatával. A CF-ben szenvedő felnőttek hajlamosabbak a gombás szenzibilizációra is, mint a nem CF-ben szenvedő betegek, valamint nagyobb arányban fordulnak elő allergiás rhinitis és atópia. Központunkban végzett retrospektív vizsgálatunkban azt találtuk, hogy az időszakosan vagy krónikus gombás fertőzésben szenvedő gyermekek tüdőfunkciója gyorsabban csökkent, mint a gombás fertőzésben nem szenvedők, függetlenül az ABPA státusztól (lásd az előzetes adatokat). Annak megértése, hogy a gombás fertőzések hátterében allergiás (Th2) gyulladásos folyamat áll-e, megváltoztathatja a kezelési megközelítést azáltal, hogy szteroidokat és gombaellenes terápiákat könnyebben alkalmaznak gombás fertőzésben szenvedő betegeknél a tüdőfunkció-csökkenés leküzdésére. Korlátozott számú tanulmányok vizsgálták a gombakórokozókkal szembeni allergiás szenzibilizáció gyakoriságát CF-ben szenvedő egyénekben, az allergiás szenzibilizáció gyakoriságát a gyermekkori CF-populációban általában, valamint a CF gombás fertőzések egyedi gyulladásos profilját és fenotípusát, mind a köpetben, mind a szérumban.

Hipotézis: Feltételezzük, hogy a CF-ben szenvedő és az ABPA nélküli gombás fertőzésben szenvedő gyermekek fokozott allergiás gyulladásos profillal és fokozott érzékenységgel rendelkeznek a gombás elemekkel szemben, mint a gombás fertőzésben nem szenvedők.

1. specifikus cél: Hasonlítsa össze a Th2-gyulladást a CF-ben szenvedő és az ABPA-ban szenvedő betegek gombás fertőzésében szenvedő és nem szenvedő betegekben.

• Megközelítés: 25 olyan betegtől veszünk szérum- és köpetmintát, akiknél vagy (1) gombás fertőzés van ABPA nélkül, n=10 (meghatározás szerint ≥ két pozitív gombakultúra az előző 18 hónapban), (2) nincs gombás fertőzés, n=10, és (3) ABPA, n=5, és specifikus köpet és szérum citokin méréseket mérünk a Th2 és Th1 gyulladásos útvonalak értékelésére.
• Mért biomarkerek: Eozinofil kationos fehérje (ECP), Interleukin-4 (IL4), Interleukin-5 (IL5), Interleukin-10 (IL10), Interleukin-13 (IL13) és eozinofilszám a szérumban és a köpetben egyaránt.
• Várt eredmény: Az APBA nélküli gombás fertőzésben szenvedő egyéneknél magasabb a gyulladás Th2 markerei, mint azoknál, akiknek nincs gombás fertőzésük. Összehasonlítjuk az ABPA-val, mint külön kontrollcsoporttal. Mérni fogjuk a Th1 markereket is, amelyeket referenciaként használunk a CF-ben korábban megállapított gyulladásos profilokhoz, és megnézzük, hogy a gombás betegségben szenvedők eltérnek-e egy inkább Th2-vezérelt folyamat felé.

2. specifikus cél: A gombaelemekkel szembeni allergiás szenzibilizáció vizsgálata CF gombás fertőzésben szenvedő betegeknél, ABPA nélkül, összehasonlítva a gombás fertőzéssel nem rendelkező betegekkel és az ABPA-s betegekkel.

• Megközelítés: Megmérjük a különböző fajok (Aspergillus, Candida stb.) gombafehérjék specifikus IgE szintjét össz-IgE és szérum ImmunoCAP vizsgálattal. gombás szenzibilizáció meghatározására. Ezenkívül felmérést fogunk végezni a betegek környezeti expozíciójára vonatkozóan, hogy feltárjuk az allergiás szenzibilizációval való összefüggéseket.
• Várt eredmény: Az ABPA nélküli gombás fertőzésben szenvedő egyének nagyobb valószínűséggel mutatnak allergiás szenzibilizációt a gombás elemekre, mint azoknál, akiknek nincs gombás fertőzésük.

A tanulmány eredményei segítenek a CF gombás fertőzésekkel kapcsolatos gyulladásos profil jellemzésében, hozzájárulva a betegség fertőző és allergiás természetének megértéséhez a CF populációban. Ebből következik, hogy a CF gombás fertőzések patofiziológiájához és klinikai jellemzőihez való hozzájárulás egy lépést jelent majd a kezelési lehetőségek, a gondozási irányelvek és a betegség progressziójának megértése felé a nehezen kezelhető élőlények egyedülálló csoportja esetében.

Toborzás: Javasoljuk 25 CF-ben szenvedő, 8 és 25 év közötti beteg felvételét, akik vállalják, hogy részt vesznek ebben a keresztmetszeti vizsgálatban, amely a gombás fertőzés és az ABPA immunrendszeri jellemzőit vizsgálja. Tervezzük, hogy kiszűrjük a rutin CF-klinikájukba érkező egyéneket, és megkeressük őket a vizsgálatban való részvétel iránti érdeklődésük miatt. Ebből kifejtjük a koncepciót, a hipotézist és az ezzel kapcsolatos eljárásokat azzal a szándékkal, hogy kutatási látogatásra ütemezzük őket.

Betegválasztás: A betegeket a CHCO CF-központjából vizsgálati kutatók vagy szakképzett kutatási koordinátorok veszik fel a rutin klinikai látogatás alkalmával.

Tanulmánylátogatás: Terveink szerint 25 CF-ben szenvedő alanyt veszünk fel a klinikai stabilitás időszakában. Az alanyoknak egy kutatási klinika látogatása lesz, amely egybeesik a CHCO Pulmonary Clinic létesítményeiben tett klinikai látogatásukkal. A következő diagnosztikai információk kerülnek be az esetbejelentő űrlapokra: demográfiai adatok, diagnosztikai előzmények és mutációk, CF-hez kapcsolódó társbetegségek, történelmi mikrobiológiai eredmények, beleértve a gombatenyésztési eredményeket, gyógyszerek, beleértve a modulátoros terápiát és a hosszú távú antibiotikum-kezeléseket, korábbi allergiavizsgálatok, az ABPA diagnosztikai kritériumai (ha vannak). Ezenkívül felhasználjuk az orvosi feljegyzések történeti klinikai adatait az egyéb társbetegségek, a tüdőfunkció tendenciáinak és kiindulási állapotának, az egyéb bakteriális fertőzések anamnézisének, az allergiás diagnózisok anamnézisének, valamint az egyéb vonatkozó kórtörténeti és diagnosztikai vizsgálatok (pl. korábbi CT-vizsgálatok, korábbi vérvétel stb.). A következő értékeléseket végzik el:

• Történelmi adatok a kórlapban. A példák közé tartoznak a CF-vel kapcsolatos társbetegségek (például, de nem kizárólagosan a CF-hez kapcsolódó cukorbetegség, CF májbetegség, asztma stb.), korábbi vérvizsgálatok (például, de nem kizárólagosan a szérum IgE-szintjei, korábbi allergiavizsgálatok, bronchoszkópiás adatok és öblítési vizsgálatok, rutin és sürgős/felvételi CF laborok stb.), korábbi spirometriás és tüdőfunkciós adatok, korábbi táplálkozási és növekedési adatok (BMI, vitaminszint stb.), korábbi mikrobiológiai és tenyésztési adatok stb.
• Rendszeres CF-klinikai látogatás során kapott BMI-mérés
• A magasságot és a súlyt meg kell kapni, és ezt követően ki kell számítani.
• Rendszeres CF-klinikai látogatás során kapott tüdőfunkciós vizsgálat. A spirometriát az American Thoracic Society kritériumai szerint végzik el, míg az abszolút értékeket a Global Lung Function kezdeményezés referenciaegyenletei34 alapján előrejelzett százalékokra konvertálják.
• Köpetgyűjtés. Amennyire lehetséges, spontán köptető köpet kerül felhasználásra. Ezt a beteg otthon gyűjti össze a klinikai látogatást követő 12 órán belül egy rutin légúti légúti tisztító kúrát követően. A mintát egy feladott mintapohárba helyezik, jégre helyezik, és a klinika látogatására hozzák. Ha a vizit előtt a köpet nem üríthető ki, a megmaradt, klinikai szükségletekre fel nem használt köpet további elemzésre és tárolásra igyekszünk hasznosítani. A köpet a CFF Therapeutics Fejlesztési Hálózat jelenlegi szabványos működési eljárása szerint köpet indukálással gyűjthető, ha 1) nem tud köpni, (2) a beteg megfelel a köpetindukció klinikai kritériumainak, és (3) a klinika képes kutatási indukált köpetet végezni a jelenlegi állapot alapján. A COVID-19-re vonatkozó irányelvek a csapattagok biztonságának és a megfelelő PPE-ellátás biztosítására.

Biztonsági okokból az indukciós eljárásokat csak olyan személyeknél hajtják végre, akik az indukció napján megfelelnek a következő kritériumoknak: FEV1 ≥ 30% előre jelzett, a vizit előtt 48 órán belül nem fordult elő 5 ml-nél nagyobb hemoptysis, képes tolerálni a köpet indukciós eljárás. Megjegyzendő, hogy kevés szignifikáns különbség van a minta minőségében az analízis során a köpet és az indukált köpet között. A fent leírtak szerint tesztelendő markerek.

• Környezeti gombás expozíciós kérdőív. A klinikai látogatás befejezése előtt elvégzik. Ez a kérdőív teljes egészében egy hitelesített kérdőív, amelyet Dr. Andy Liu használt. Tekintettel a vizsgálatban résztvevők időkorlátaira, egy módosított kérdőívet használunk, amely a jelen tanulmányban érdekelt kérdésekre összpontosít (pl. gombás expozícióval kapcsolatos). Ezt nem validálták, de fontos információkkal szolgálhat ebben a kísérleti tanulmányban a jövőbeli kutatásokhoz

• Szérum gyűjtemény. A perifériás vénás vérvételt a CTRC által igazolt személy végzi a megfelelő steril technikával. A mintákat a kutatási protokoll szabványai szerint címkézik. A fent leírt tesztelendő markerek.

  • Az összes köpetmintát bankba kell helyezni és el kell menteni a potenciális mikrobiom-, mikobióm- és transzkriptomanalízishez, a különféle gyulladásos útvonalakra jellemző génexpressziók értékelésére.

A mintaméret becslése: A vizsgálati javaslat teljesítménye és mintamérete rögzített, mivel a vizsgálati időszak alatt ebbe a kísérleti vizsgálatba be kell vonni a megfelelő betegeket. Az előzetes adatok és a fertőzéstípusok leírt definíciói alapján a kutatók arra számítanak, hogy egy 1 éves toborzási időszak alatt körülbelül 10 gombás fertőzésben nem szenvedő, 10 gombás fertőzésben szenvedő, de nem ABPA-ban szenvedő beteget és 5 ABPA-s beteget tudnak majd bevonni. . Az elsődleges elemzési terv a 3. táblázatban leírt kulcsfontosságú plazma- és köpetmérések leírására és összehasonlítására összpontosít. A teljesítményelemzés megadja a kimutatható hatásméreteket, amikor a kontroll kart (nincs gombás fertőzés) összehasonlítja a nem ABPA csoporttal vagy az ABPA csoporttal. A számítások 80%-os hatványon és 0,05-ös I. típusú hibaarányon alapulnak a kétoldalas, kétmintás egyenlő varianciájú t-próbára, amelyet a PASS 15-ös statisztikai szoftverrel végeztek (2). A 10-es és 5-ös csoportminta a gombás fertőzéses csoportokban 80%-os teljesítményt ér el a nulla hatásméret nullhipotézisének elutasítására, ha a populáció hatás mérete 1,36, illetve 1,66. Így a vizsgálatot 80%-ban hajtják végre, hogy a mérendő átlagos markerek között 1,66 és 1,32 szórásnál nagyobb különbséget észleljen. Tekintettel arra, hogy az irodalomban korlátozott mennyiségű adat áll rendelkezésre a CF-ben előforduló Th2 markerekre vonatkozóan, ezeket a számításokat az általunk tesztelt több Th2 marker átlagától való eltérésekre alapozzuk.

Adatgyűjtés és -tárolás: A vizsgálati mintagyűjtés során minden alany azonosítása megtörténik, és mesterkulccsal tárolódik. A PI korlátozott hozzáféréssel rendelkezik ezekhez az információkhoz, és csak a lényeges kutatószemélyzet fogja tudni nyomon követni és megtekinteni az adatokat. Minden nyomtatott forrásdokumentumot a CF kutatócsoport tárolóhelyiségében egy zárt iratszekrényben tárolnak. Ezen túlmenően az adatok integritásának további biztosítása érdekében a tanulmány adatait a Research Electronic Data Capture rendszerben (REDCap) tároljuk, amely csak a lényeges személyes adatok számára tesz lehetővé korlátozott hozzáférést. A REDCap lehetővé teszi az in-line érvényesítést, hogy minimalizálja az átírási hibákat, és valós idejű értesítést ad az adatok benyújtásáról, valamint azonnali központi felügyeletet és visszacsatolást tesz lehetővé. Az adatokhoz való hozzáférés titkosított biztonságos socket réteg (SSL) kapcsolatot igényel, és a változásokat felhasználói azonosító, időbélyeg és projekt naplózza. Az adatbázisokról gyakran készül biztonsági mentés.