Иммунные профили при грибковой инфекции CF

В то время как бактерии являются преобладающими агентами при МВ заболеваниях легких, грибы часто выделяют как в мокроте, так и в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), однако их роль при МВ до конца не изучена. Грибковая инфекция при муковисцидозе имеет широкий спектр проявлений, варьирующий от транзиторного выявления до персистирующей инфекции, острого грибкового бронхита с последующим обострением легочных заболеваний, сенсибилизацией к грибковым аллергенам и аллергическим бронхолегочным аспергиллезом (АБЛА). В то время как существуют клинические рекомендации по диагностике и лечению АБЛА у пациентов с муковисцидозом, руководств и рекомендаций относительно мониторинга, клинической помощи и противогрибкового лечения при различных проявлениях грибкового заболевания муковисцидоза немного; кроме того, клиническое воздействие грибков без ABPA плохо изучено. В то время как воспаление при МВ классически считается процессом, управляемым нейтрофилами и макрофагами (Th1), было показано, что эозинофилы и аллергические цитокины (Th2) повышены при наличии грибкового заболевания как в клинических исследованиях, так и в исследованиях на животных. Исследования также показали снижение функции легких (например, прогнозируемый объем форсированного выдоха за одну секунду, ppFEV1) у лиц с частым обнаружением грибков в мокроте, а также связь с Pseudomonas инфекцией и использованием противомикробных препаратов. Взрослые с МВ также более склонны к грибковой сенсибилизации по сравнению с пациентами без МВ, а также имеют более высокие показатели аллергического ринита и атопии. В ретроспективном исследовании, проведенном в нашем центре, мы обнаружили, что у детей с перемежающейся или хронической грибковой инфекцией наблюдалось более быстрое снижение функции легких по сравнению с детьми без грибковых инфекций независимо от статуса ABPA (см. предварительные данные). Понимание того, вызваны ли грибковые инфекции аллергическим (Th2) воспалительным процессом, может изменить подходы к лечению путем более активного использования стероидов и противогрибковой терапии у пациентов с грибковой инфекцией для борьбы со снижением функции легких. В ограниченных исследованиях изучалась частота аллергической сенсибилизации к грибковым патогенам у лиц с МВ, частота аллергической сенсибилизации в педиатрической популяции МВ в целом, а также уникальные воспалительные профили и фенотипы грибковых инфекций МВ как в мокроте, так и в сыворотке.

Гипотеза. Мы предполагаем, что дети с муковисцидозом и грибковыми инфекциями без ABPA будут иметь повышенный профиль аллергического воспаления и повышенную чувствительность к грибковым элементам по сравнению с детьми без грибковой инфекции.

Конкретная цель 1: Сравнить воспаление Th2 у пациентов с грибковыми инфекциями и без них у пациентов с муковисцидозом и у пациентов с АБЛА.

• Подход: мы получим образцы сыворотки и мокроты от 25 пациентов с (1) грибковой инфекцией без ABPA, n = 10 (определяется как ≥ двух положительных грибковых культур в предыдущие 18 месяцев), (2) без грибковой инфекции, n = 10, и (3) ABPA, n = 5, и измерение специфических показателей цитокинов в мокроте и сыворотке для оценки воспалительных путей Th2 и Th1.
• Измеряемые биомаркеры: эозинофильный катионный белок (ECP), интерлейкин-4 (IL4), интерлейкин-5 (IL5), интерлейкин-10 (IL10), интерлейкин-13 (IL13) и количество эозинофилов как в сыворотке, так и в мокроте.
• Ожидаемый результат: лица с грибковой инфекцией без APBA будут иметь повышенные маркеры воспаления Th2 по сравнению с лицами без грибковой инфекции. Мы также сравним пациентов с ABPA в качестве отдельной контрольной группы. Мы также будем измерять маркеры Th1, которые будут использоваться в качестве ссылки на ранее установленные воспалительные профили, наблюдаемые при МВ, чтобы увидеть, отклоняются ли люди с грибковым заболеванием в сторону процесса, в большей степени управляемого Th2.

Конкретная цель 2: исследовать аллергическую сенсибилизацию к грибковым элементам у пациентов с грибковой инфекцией CF без ABPA по сравнению с пациентами без грибковой инфекции и с пациентами с ABPA.

• Подход: мы будем измерять общий IgE и тест ImmunoCAP в сыворотке на конкретные уровни IgE к грибковым белкам различных видов (Aspergillus, Candida и т. д.). для определения грибковой сенсибилизации. Мы также проведем опрос пациентов относительно воздействия окружающей среды, чтобы изучить связь с аллергической сенсибилизацией.
• Ожидаемый результат: люди с грибковой инфекцией без ABPA с большей вероятностью проявят аллергическую сенсибилизацию к грибковым элементам по сравнению с людьми без грибковой инфекции.

Результаты этого исследования помогут охарактеризовать воспалительный профиль, связанный с грибковыми инфекциями МВ, способствуя пониманию как инфекционной, так и аллергической природы заболевания у пациентов с МВ. Исходя из этого, вклад как в патофизиологию, так и в клинические характеристики грибковых инфекций CF послужит шагом к пониманию вариантов лечения, рекомендаций по уходу и прогрессирования заболевания для этого уникального набора трудно поддающихся лечению организмов.

Набор: мы предлагаем набрать 25 пациентов с муковисцидозом в возрасте от 8 до 25 лет, которые согласны участвовать в этом поперечном исследовании, посвященном характеристикам иммунной системы при грибковой инфекции и АБЛА. Мы планируем проводить скрининг людей, приходящих в свою обычную клинику МВ, и обращаться к ним по поводу их заинтересованности в участии в этом исследовании. Исходя из этого, мы объясним концепцию, гипотезу и процедуры, связанные с намерением запланировать их для исследовательского визита.

Отбор пациентов: Пациенты будут набираться из Центра CF в CHCO исследователями исследования или квалифицированными координаторами исследования во время обычного визита в клинику.

Учебный визит: мы планируем проспективно набрать 25 пациентов с муковисцидозом в течение периода клинической стабильности. Субъекты будут иметь один визит в исследовательскую клинику, который будет совпадать с их визитом в пульмонологическую клинику CHCO. Следующая диагностическая информация будет введена в формы отчета о болезни: демографическая информация, история диагностики и мутации, сопутствующие заболевания, связанные с муковисцидозом, исторические результаты микробиологии, включая результаты грибковых культур, лекарства, включая терапию модуляторами и длительные схемы антибиотикотерапии, предыдущие тесты на аллергию, диагностические критерии АБЛА (если применимо). Мы также будем использовать исторические клинические данные из медицинской документации, чтобы установить другие сопутствующие заболевания, тенденции функции легких и исходный уровень, историю других бактериальных инфекций, историю диагнозов аллергии и другую соответствующую историю болезни и диагностические тесты (например, предыдущие результаты КТ, предыдущий анализ крови и др.). Будут проведены следующие оценки:

• Исторические данные в медицинской карте. Примеры включают сопутствующие заболевания, связанные с МВ (например, диабет, связанный с МВ, заболевание печени при МВ, астму и т. д.), предшествующие анализы крови (например, уровень IgE в сыворотке, предыдущие тесты на аллергию, данные бронхоскопии и т. д.). исследования лаважа, рутинные и неотложные/при госпитализации лабораторные исследования муковисцидоза и т. д.), предыдущие данные спирометрии и функции легких, предыдущие данные о питании и росте (ИМТ, ​​уровни витаминов и т. д.), предыдущие микробиологические и культуральные данные и т. д.
• Измерения ИМТ, полученные при регулярном посещении клиники CF
• Рост и вес должны быть получены и впоследствии рассчитаны.
• Исследование функции легких, полученное при регулярном посещении клиники муковисцидоза. Спирометрия будет проводиться в соответствии с критериями Американского торакального общества, а абсолютные значения будут преобразованы в проценты, рассчитанные с использованием эталонных уравнений инициативы Global Lung Function34.
• Сбор мокроты. По мере возможности будет использоваться спонтанно отхаркивающаяся мокрота. Она будет собрана пациентом дома в соответствии с обычным режимом очистки дыхательных путей в течение 12 часов после посещения клиники. Образец будет помещен в отправленный по почте стакан для образцов, помещен на лед и доставлен в клинику. Если мокроту невозможно отхаркнуть до визита, мы попытаемся использовать оставшуюся отхаркивающуюся мокроту, которая не используется для клинических нужд, для дальнейшего анализа и хранения. Мокроту можно собрать путем индукции мокроты в соответствии с действующей стандартной операционной процедурой CFF Therapeutics Development Network, если 1) невозможно откашлять мокроту, (2) пациент соответствует клиническим критериям для индукции мокроты и (3) клиника может провести исследование индуцированной мокроты на основе текущих данных. Руководство по COVID-19 для обеспечения безопасности члена команды и адекватного снабжения СИЗ.

Из соображений безопасности процедуры индукции будут выполняться только для субъектов, которые в день индукции соответствуют следующим критериям: ОФВ1 ≥ 30% от должного, Отсутствие в анамнезе > 5 мл кровохарканья в течение 48 часов до визита, Способность переносить процедура индукции мокроты. Следует отметить, что существует небольшая существенная разница в качестве образцов для анализа между откашливаемой и индуцированной мокротой. Маркеры для тестирования, как описано выше.

• Опросник по воздействию грибков в окружающей среде. Будет выполнено до окончания визита в клинику. Эта анкета в целом является утвержденной анкетой, используемой доктором Энди Лю. Учитывая временные ограничения для участников исследования, мы используем модифицированную анкету, ориентированную на вопросы, интересующие данное исследование (например, в отношении воздействия грибка). Это не было подтверждено, но может предоставить важную информацию в этом пилотном исследовании для будущих исследований.

• Сбор сыворотки. Забор периферической венозной крови будет выполняться сертифицированным специалистом с использованием соответствующей стерильной техники CTRC. Образцы будут маркированы в соответствии со стандартами протокола исследования. Маркеры для тестирования описаны выше.

  • Все образцы мокроты должны быть сохранены для анализа потенциального микробиома, микобиома и транскриптома, оценки экспрессии генов, уникальных для различных путей воспаления.

Оценки размера выборки: Мощность и размер выборки для предложения об исследовании фиксированы из-за ожидаемого количества подходящих пациентов, которые будут набраны в это пилотное исследование в течение исследовательского окна. Основываясь на предварительных данных и описанных определениях типов инфекции, исследователи ожидают, что в течение 1 года они смогут набрать примерно 10 человек без грибковой инфекции, 10 пациентов с грибковой инфекцией, но без АБЛА, и 5 пациентов с АБЛА. . План первичного анализа фокусируется на описании и сравнении ключевых показателей плазмы и мокроты, описанных в Таблице 3. Анализ мощности обеспечивает обнаруживаемые размеры эффекта при сравнении контрольной группы (без грибковой инфекции) с группой, не применявшей ABPA, или группой, принимавшей ABPA. Расчеты основаны на мощности 80% и частоте ошибок типа I 0,05 для двустороннего двухвыборочного равнодисперсионного t-критерия, проведенного в статистическом программном обеспечении PASS версии 15 (2). Размер групповой выборки 10 и 5 в группах грибковой инфекции достигает 80% мощности, чтобы отвергнуть нулевую гипотезу о нулевом размере эффекта, когда размер эффекта популяции составляет 1,36 и 1,66 соответственно. Таким образом, мощность исследования составляет 80%, чтобы обнаружить разницу в средних измеряемых маркерах, превышающую 1,66 и 1,32 стандартных отклонения. Учитывая ограниченные данные в литературе, касающиеся маркеров Th2 при муковисцидозе, мы основываем эти расчеты на отклонениях от среднего для нескольких маркеров Th2, которые мы тестируем.

Сбор и хранение данных. Все субъекты будут деидентифицированы после сбора образцов для исследования и сохранены с помощью главного ключа. Доступ к этой информации будет ограничен PI, и только основной исследовательский персонал сможет отслеживать и просматривать данные. Все печатные исходные документы будут храниться в запираемом картотеке в хранилище исследовательской группы CF. Кроме того, для дальнейшего обеспечения целостности данных данные для этого исследования будут храниться в системе сбора электронных данных исследований (REDCap), что обеспечит ограниченный доступ только для основных лиц. REDCap обеспечивает встроенную проверку, чтобы свести к минимуму ошибки транскрипции, и предоставляет уведомления в режиме реального времени о представлении данных, а также обеспечивает немедленный централизованный мониторинг и обратную связь. Для доступа к данным требуется зашифрованное соединение уровня защищенных сокетов (SSL), а изменения регистрируются по идентификатору пользователя, отметке времени и проекту. Базы данных часто резервируются.