Imunitní profily u CF plísňové infekce

Zatímco bakterie jsou převládajícími agens u CF plicního onemocnění, houby jsou často izolovány jak ve sputu, tak v tekutině z bronchoalveolární laváže (BAL), ale jejich role v CF není plně objasněna. Plísňová infekce u CF má široké spektrum prezentací, od přechodné detekce po perzistující infekci, akutní plísňovou bronchitidu s následnou plicní exacerbací, senzibilizaci na plísňové alergeny a alergickou bronchopulmonální aspergilózu (ABPA). I když existují klinické pokyny pro diagnostiku a léčbu ABPA u pacientů s CF, existuje jen málo pokynů a doporučení týkajících se monitorování, klinické péče a antimykotické léčby u různých projevů plísňového onemocnění CF; dále je klinický dopad hub bez ABPA špatně pochopen. Zatímco zánět u CF je klasicky považován za proces řízený neutrofily a makrofágy (Th1), eozinofily a alergické cytokiny (Th2) se v klinických studiích i studiích CF na zvířatech ukázaly jako zvýšené v přítomnosti plísňového onemocnění. Studie také prokázaly sníženou funkci plic (např. procento předpokládaného objemu usilovného výdechu za jednu sekundu, ppFEV1) u jedinců s častou detekcí plísní ve sputu a souvislostmi s infekcí Pseudomonas a používáním antimikrobiálních látek. Dospělí s CF jsou také náchylnější k plísňové senzibilizaci ve srovnání s pacienty bez CF a mají také vyšší výskyt alergické rýmy a atopie. V retrospektivní studii provedené v našem centru jsme zjistili, že u dětí s intermitentními nebo chronickými plísňovými infekcemi došlo k rychlejšímu poklesu plicních funkcí ve srovnání s dětmi bez plísňových infekcí bez ohledu na stav ABPA (viz předběžné údaje). Pochopení toho, zda jsou plísňové infekce řízeny alergickým (Th2) zánětlivým procesem, může změnit léčebné přístupy tím, že se u pacientů s plísňovou infekcí v boji proti poklesu funkce plic snadněji použijí steroidy a antifungální terapie. Omezené studie zkoumaly frekvenci alergické senzibilizace na houbové patogeny u jedinců s CF, frekvenci alergické senzibilizace v dětské populaci s CF obecně a jedinečné profily zánětu a fenotypy mykotických infekcí CF, a to jak ve sputu, tak v séru.

Hypotéza: Předpokládáme, že děti s CF a plísňovými infekcemi bez ABPA budou mít zvýšený alergický zánětlivý profil a zvýšenou senzibilizaci na plísňové elementy ve srovnání s dětmi bez plísňové infekce.

Specifický cíl 1: Porovnat zánět Th2 u pacientů s a bez mykotických infekcí u pacientů s CF au pacientů s ABPA.

• Přístup: Získáme vzorky séra a sputa od 25 pacientů buď s (1) plísňovou infekcí bez ABPA, n=10 (definováno jako ≥ dvě pozitivní plísňové kultury v předchozích 18 měsících), (2) bez plísňové infekce, n=10, a (3) ABPA, n=5, a měření specifických měření sputa a sérových cytokinů pro hodnocení Th2 a Th1 zánětlivých drah.
• Měřené biomarkery: Eosinofilní kationtový protein (ECP), Interleukin-4 (IL4), Interleukin-5 (IL5), Interleukin-10 (IL10), Interleukin-13 (IL13) a počet eozinofilů v séru i ve sputu.
• Očekávaný výsledek: Jedinci s plísňovou infekcí bez APBA budou mít zvýšené Th2 markery zánětu ve srovnání s těmi, kteří plísňovou infekci nemají. Budeme také porovnávat s těmi, u kterých je ABPA jako samostatná kontrolní skupina. Budeme také měřit Th1 markery, které se mají použít jako reference k dříve stanoveným zánětlivým profilům pozorovaným u CF, abychom viděli, zda se ti s plísňovým onemocněním odchylují směrem k procesu více řízenému Th2.

Specifický cíl 2: Prozkoumat alergickou senzibilizaci na plísňové elementy u pacientů s CF plísňovou infekcí bez ABPA ve srovnání s pacienty bez plísňové infekce as pacienty s ABPA.

• Přístup: Budeme měřit celkové IgE a sérové ​​ImmunoCAP testování specifických hladin IgE na proteiny hub různých druhů (Aspergillus, Candida atd.). k určení plísňové senzibilizace. Rovněž provedeme průzkum pacientů ohledně expozice životního prostředí, abychom prozkoumali vztahy s alergickou senzibilizací.
• Očekávaný výsledek: Jedinci s plísňovou infekcí bez ABPA budou pravděpodobněji vykazovat alergickou senzibilizaci na plísňové prvky ve srovnání s těmi, kteří plísňovou infekci nemají.

Výsledky této studie pomohou charakterizovat zánětlivý profil spojený s plísňovými infekcemi CF, což přispěje k pochopení jak infekční, tak alergické povahy onemocnění v populaci CF. Z toho vyplývá, že příspěvek k patofyziologii a klinickým charakteristikám CF mykotických infekcí poslouží jako krok k pochopení možností léčby, pokynů pro péči a progrese onemocnění u tohoto jedinečného souboru obtížně léčitelných organismů.

Nábor: Navrhujeme přijmout 25 pacientů s CF ve věku od 8 do 25 let, kteří souhlasí s účastí v této průřezové studii zaměřené na charakteristiky imunitního systému mykotické infekce a ABPA. Plánujeme provést screening jednotlivců přicházejících na jejich rutinní CF kliniku a oslovit je ohledně jejich zájmu o účast v této studii. Z toho vysvětlíme koncept, hypotézu a postupy, které se týkají toho, abychom je naplánovali na výzkumnou návštěvu.

Výběr pacientů: Pacienti budou rekrutováni z CF Centra v CHCO výzkumnými pracovníky studie nebo kvalifikovanými koordinátory výzkumu v době rutinní návštěvy kliniky.

Studijní návštěva: Plánujeme prospektivně přijmout 25 subjektů s CF během období klinické stability. Subjekty absolvují jednu výzkumnou kliniku, která se bude shodovat s jejich klinickou návštěvou v zařízeních CHCO plicní kliniky. Do formulářů kazuistiky budou zadány následující diagnostické informace: demografické informace, diagnostická historie a mutace, komorbidity související s CF, historické výsledky mikrobiologie včetně výsledků mykotických kultur, léky včetně modulátorové terapie a dlouhodobé antibiotické režimy, předchozí testování na alergie, diagnostická kritéria pro ABPA (pokud jsou relevantní). Použijeme také historická klinická data z lékařského záznamu ke stanovení dalších komorbidit, trendů plicních funkcí a výchozích hodnot, historie jiných bakteriálních infekcí, historie diagnóz alergií a další související anamnéza a diagnostická vyšetření (tj. předchozí výsledky CT vyšetření, předchozí krevní obraz atd.). Budou provedena tato hodnocení:

• Historická data v lékařském záznamu. Příklady zahrnují komorbidní diagnózy související s CF (jako je, ale bez omezení na diabetes související s CF, CF onemocnění jater, astma atd.), předchozí krevní testy (jako jsou, ale bez omezení na, hladiny IgE v séru, předchozí testy na alergie, bronchoskopické údaje a lavážní studie, rutinní a urgentní/přijímací CF laboratoře atd.), předchozí údaje ze spirometrie a plicních funkcí, předchozí údaje o výživě a růstu (BMI, hladiny vitamínů atd.), předchozí údaje o mikrobiologii a kultuře atd.
• BMI měření získané z pravidelné návštěvy CF kliniky
• Výška a hmotnost, které je třeba získat a následně vypočítat.
• Testování funkce plic získané z pravidelné návštěvy CF kliniky. Spirometrie bude prováděna podle kritérií American Thoracic Society, zatímco absolutní hodnoty budou převedeny na procenta předpovězená pomocí referenčních rovnic iniciativy Global Lung Function34.
• Sběr sputa. Bude použito spontánně expektorované sputum, jak je to možné. Toto bude pacientovi odebráno doma po rutinním režimu čištění dýchacích cest do 12 hodin od návštěvy kliniky. Vzorek bude umístěn do zaslaného vzorkového pohárku a umístěn na led a přinesen na návštěvu kliniky. Pokud nelze sputum před návštěvou vykašlat, pokusíme se využít zbývající vykašlávané sputum, které není použito pro klinické potřeby, pro další analýzu a skladování. Sputum lze odebrat indukcí sputa podle aktuálního standardního operačního postupu CFF Therapeutics Development Network, pokud 1) není schopen expektorovat, (2) pacient splňuje klinická kritéria pro indukci sputa a (3) klinika je schopna provést výzkumem indukované sputum na základě aktuálního Pokyny pro COVID-19 k zajištění bezpečnosti člena týmu a dostatečné dodávky OOPP.

Z bezpečnostních důvodů budou indukční procedury provedeny pouze u subjektů, které v den indukce splňují následující kritéria: FEV1 ≥ 30 % předpokládaná, bez anamnézy > 5 ml hemoptýzy během 48 hodin před návštěvou, schopné tolerovat postup indukce sputa. Je třeba poznamenat, že existuje malý významný rozdíl v kvalitě vzorku pro analýzu mezi expektorovaným a indukovaným sputem. Markery, které mají být testovány, jak bylo popsáno výše.

• Dotazník environmentální expozice plísním. Provede se před ukončením návštěvy kliniky. Celý tento dotazník je ověřený dotazník používaný Dr. Andy Liu. Vzhledem k časovému omezení pro účastníky studie používáme upravený dotazník zaměřený na otázky, které tato studie zajímá (např. týkající se expozice houbám). To nebylo ověřeno, ale může poskytnout důležité informace v této pilotní studii pro budoucí výzkum

• Sbírka séra. Odběr periferní žilní krve provede certifikovaná osoba za použití vhodné sterilní techniky CTRC. Vzorky budou označeny podle standardů výzkumného protokolu. Značky k testování popsané výše.

  • Všechny vzorky sputa budou uloženy a uloženy pro potenciální analýzu mikrobiomu, mykobiomu a transkriptomu, přičemž se hodnotí genové exprese jedinečné pro různé zánětlivé dráhy.

Odhady velikosti vzorku: Výkon a velikost vzorku pro návrh studie jsou pevné kvůli očekávanému počtu vhodných pacientů, kteří mají být přijati do této pilotní studie během období studie. Na základě předběžných údajů a popsaných definic typů infekce vyšetřovatelé předpokládají, že během 1letého období náboru budou moci zapsat přibližně 10 jedinců bez plísňové infekce, 10 pacientů s plísňovou infekcí, ale bez ABPA a 5 s ABPA. . Plán primární analýzy se zaměřuje na popis a srovnání klíčových měření plazmy a sputa popsaných v tabulce 3. Analýza síly poskytuje detekovatelné velikosti účinku při porovnání kontrolní větve (bez plísňové infekce) buď se skupinou bez ABPA, nebo se skupinou ABPA. Výpočty jsou založeny na síle 80 % a chybovosti typu I 0,05 pro oboustranný dvouvýběrový t-test s rovnoměrným rozptylem prováděný ve statistickém softwaru PASS verze 15 (2). Velikosti skupinových vzorků 10 a 5 ve skupinách s plísňovou infekcí dosahují 80% síly k zamítnutí nulové hypotézy o velikosti nulového účinku, když velikost účinku v populaci je 1,36 a 1,66 v tomto pořadí. Studie je tedy napájena na 80 %, aby se detekoval rozdíl v průměrných měřených markerech větší než 1,66 a 1,32 standardní odchylky. Vzhledem k omezeným údajům v literatuře ohledně Th2 markerů u CF zakládáme tyto výpočty na odchylkách od průměru pro více markerů Th2, které testujeme.

Sběr a ukládání dat: Všechny subjekty budou po odběru studijních vzorků deidentifikace a uloženy pomocí hlavního klíče. S PI bude omezený přístup k těmto informacím a pouze základní výzkumní pracovníci budou moci sledovat a prohlížet data. Všechny tištěné zdrojové dokumenty budou uchovávány v uzamčené kartotéce ve skladech výzkumného týmu CF. Navíc, aby byla dále zajištěna integrita dat, budou data pro tuto studii uložena v systému Research Electronic Data Capture (REDCap), který umožní omezený přístup pouze k základním osobám. REDCap umožňuje in-line validaci, aby se minimalizovaly chyby přepisu, a poskytuje v reálném čase upozornění na odeslání dat a umožňuje okamžité centrální monitorování a zpětnou vazbu. Přístup k datům vyžaduje šifrované připojení SSL (Secure Socket Layer) a změny jsou protokolovány podle ID uživatele, časového razítka a projektu. Databáze jsou často zálohovány.