Immuunprofielen bij CF-schimmelinfectie

Hoewel bacteriën de overheersende verwekkers zijn bij CF-longziekte, worden schimmels vaak geïsoleerd in zowel sputum als bronchoalveolaire lavagevloeistof (BAL), maar hun rol bij CF wordt niet volledig begrepen. Schimmelinfectie bij CF heeft een breed spectrum aan presentaties, variërend van voorbijgaande detectie tot aanhoudende infectie, acute schimmelbronchitis met als gevolg longexacerbatie, sensibilisatie voor schimmelallergenen en allergische bronchopulmonale aspergillose (ABPA). Hoewel er klinische richtlijnen zijn voor de diagnose en behandeling van ABPA bij patiënten met CF, zijn er weinig richtlijnen en aanbevelingen met betrekking tot monitoring, klinische zorg en antischimmelbehandeling bij de verschillende presentaties van CF-schimmelziekte; verder wordt de klinische impact van schimmels zonder ABPA slecht begrepen. Hoewel ontsteking bij CF klassiek wordt beschouwd als een door neutrofielen en macrofagen aangedreven proces (Th1), is aangetoond dat eosinofielen en allergische cytokines (Th2) verhoogd zijn in de aanwezigheid van schimmelziekte in zowel klinische als dierstudies bij CF. Studies hebben ook een verminderde longfunctie aangetoond (bijv. procent voorspeld geforceerd expiratoir volume in één seconde, ppFEV1) bij personen met frequente schimmeldetectie in hun sputum, en associaties met Pseudomonas-infectie en gebruik van antimicrobiële middelen. Volwassenen met CF zijn ook vatbaarder voor schimmelsensibilisatie in vergelijking met niet-CF-patiënten en hebben ook vaker allergische rhinitis en atopie. In een retrospectieve studie die in ons centrum werd uitgevoerd, ontdekten we dat kinderen met intermitterende of chronische schimmelinfecties een snellere achteruitgang van de longfunctie ervoeren in vergelijking met kinderen zonder schimmelinfecties, ongeacht de ABPA-status (zie voorlopige gegevens). Begrijpen of schimmelinfecties worden veroorzaakt door een allergisch (Th2) ontstekingsproces, kan de behandelingsbenadering veranderen door steroïden en antischimmeltherapieën gemakkelijker te gebruiken bij patiënten met een schimmelinfectie om achteruitgang van de longfunctie tegen te gaan. Beperkte studies hebben de frequentie van allergische sensibilisatie voor schimmelpathogenen onderzocht bij personen met CF, de frequentie van allergische sensibilisatie bij de pediatrische CF-populatie in het algemeen, en de unieke ontstekingsprofielen en fenotypes van CF-schimmelinfecties, zowel in het sputum als in het serum.

Hypothese: We veronderstellen dat kinderen met CF en schimmelinfecties zonder ABPA verhoogde allergische ontstekingsprofielen en verhoogde sensibilisatie voor schimmelelementen zullen hebben in vergelijking met kinderen zonder schimmelinfectie.

Specifiek doel 1: Vergelijk Th2-ontsteking bij patiënten met en zonder schimmelinfecties bij patiënten met CF en bij patiënten met ABPA.

• Aanpak: We zullen serum- en sputummonsters nemen van 25 patiënten met ofwel (1) schimmelinfectie zonder ABPA, n=10 (gedefinieerd als ≥ twee positieve schimmelkweken in voorgaande 18 maanden), (2) geen schimmelinfectie, n=10, en (3) ABPA, n=5, en meet specifieke sputum- en serumcytokinemetingen om Th2- en Th1-ontstekingsroutes te evalueren.
• Gemeten biomarkers: eosinofiel kationisch eiwit (ECP), interleukine-4 (IL4), interleukine-5 (IL5), interleukine-10 (IL10), interleukine-13 (IL13) en aantal eosinofielen in zowel serum als sputum.
• Verwacht resultaat: personen met een schimmelinfectie zonder APBA hebben verhoogde Th2-markers voor ontsteking in vergelijking met personen zonder schimmelinfectie. We zullen ook vergelijken met degenen met ABPA als een aparte controlegroep. We zullen ook Th1-markers meten om te gebruiken als referentie naar eerder vastgestelde ontstekingsprofielen die worden gezien bij CF, om te zien of mensen met een schimmelziekte afwijken in de richting van een meer door Th2 aangedreven proces.

Specifiek doel 2: onderzoek naar allergische sensibilisatie voor schimmelelementen bij patiënten met CF-schimmelinfectie zonder ABPA in vergelijking met patiënten zonder schimmelinfectie en patiënten met ABPA.

• Aanpak: We zullen totale IgE- en serum ImmunoCAP-testen meten van specifieke IgE-niveaus voor schimmeleiwitten van verschillende soorten (Aspergillus, Candida, enz.). om schimmelsensibilisatie te bepalen. We zullen ook patiënten ondervragen over blootstelling aan het milieu om relaties met allergische sensibilisatie te onderzoeken.
• Verwacht resultaat: personen met een schimmelinfectie zonder ABPA zullen eerder allergische sensibilisatie voor schimmelelementen vertonen in vergelijking met personen zonder schimmelinfectie.

De resultaten van deze studie zullen helpen bij het karakteriseren van het ontstekingsprofiel geassocieerd met CF-schimmelinfecties, wat bijdraagt ​​aan het begrip van zowel de infectieuze als de allergische aard van ziekte bij de CF-populatie. Hieruit zal de bijdrage aan zowel de pathofysiologie als de klinische kenmerken van CF-schimmelinfecties dienen als een stap naar het begrijpen van managementopties, zorgrichtlijnen en ziekteprogressie voor deze unieke reeks moeilijk te behandelen organismen.

Werving: We stellen voor om 25 patiënten met CF in de leeftijd van 8 tot 25 jaar te werven die ermee instemmen om deel te nemen aan deze cross-sectionele studie waarin wordt gekeken naar de kenmerken van het immuunsysteem van schimmelinfectie en ABPA. We zijn van plan om personen die naar hun reguliere CF-kliniek komen te screenen en hen te benaderen met betrekking tot hun interesse in deelname aan deze studie. Hieruit zullen we het concept, de hypothese en de betrokken procedures uitleggen met de bedoeling om ze in te plannen voor een onderzoeksbezoek.

Patiëntselectie: Patiënten worden gerekruteerd uit het CF-centrum van CHCO door onderzoeksonderzoekers of gekwalificeerde onderzoekscoördinatoren tijdens een routinebezoek aan de kliniek.

Studiebezoek: We zijn van plan om prospectief 25 proefpersonen met CF te werven gedurende een periode van klinische stabiliteit. Proefpersonen krijgen één bezoek aan een onderzoekskliniek dat samenvalt met hun bezoek aan de kliniek in de faciliteiten van de CHCO Pulmonary Clinic. De volgende diagnostische informatie zal worden ingevoerd op Case Report Forms: demografische informatie, diagnostische geschiedenis en mutaties, CF-gerelateerde co-morbiditeiten, historische microbiologische resultaten inclusief schimmelkweekresultaten, medicatie inclusief modulatortherapie en langdurige antibioticaregimes, eerdere allergietesten, diagnostische criteria voor ABPA (indien van toepassing). We zullen ook historische klinische gegevens uit het medisch dossier gebruiken om andere comorbiditeiten, longfunctietrends en basislijn, geschiedenis van andere bacteriële infecties, geschiedenis van allergiediagnoses en andere relevante medische geschiedenis en diagnostische tests vast te stellen (dwz eerdere CT-scanresultaten, eerder bloedonderzoek, enz.). De volgende evaluaties zullen worden uitgevoerd:

• Historische gegevens in het medisch dossier. Voorbeelden zijn onder meer comorbide diagnoses gerelateerd aan CF (zoals maar niet beperkt tot CF-gerelateerde diabetes, CF-leverziekte, astma, enz.), eerder bloedonderzoek (zoals maar niet beperkt tot serum-IgE-spiegels, eerdere allergietesten, bronchoscopiegegevens en lavage-onderzoeken, routinematige en urgente/opname CF-labs, enz.), eerdere spirometer- en longfunctiegegevens, eerdere voedings- en groeigegevens (BMI, vitamineniveaus, enz.), eerdere microbiologische en kweekgegevens, enz.
• BMI-metingen verkregen bij een regelmatig bezoek aan de CF-kliniek
• Lengte en gewicht worden verkregen en vervolgens berekend.
• Longfunctietesten verkregen na regelmatig bezoek aan de CF-kliniek. Spirometrie zal worden uitgevoerd volgens de criteria van de American Thoracic Society, terwijl absolute waarden zullen worden geconverteerd naar percentage voorspeld met behulp van de Global Lung Function Initiative-referentievergelijkingen34.
• Sputum verzameling. Spontaan opgehoest sputum zal zoveel mogelijk worden gebruikt. Dit wordt door de patiënt thuis verzameld volgens een routinematig schema voor het vrijmaken van de luchtwegen binnen 12 uur na het bezoek aan de kliniek. Het monster wordt in een gemailde monsterbeker geplaatst en op ijs geplaatst en naar het bezoek aan de kliniek gebracht. Als het sputum niet kan worden opgehoest voorafgaand aan het bezoek, zullen we proberen het resterende sputum dat niet wordt gebruikt voor klinische behoeften te gebruiken voor verdere analyse en opslag. Sputum kan worden verzameld door middel van sputuminductie volgens de huidige standaardwerkwijze van het CFF Therapeutics Development Network als 1) niet in staat is om op te slijmen, (2) de patiënt voldoet aan de klinische criteria voor sputuminductie en (3) de kliniek in staat is om onderzoeksgeïnduceerd sputum uit te voeren op basis van de huidige COVID-19-richtlijnen om de veiligheid van teamleden en voldoende PBM-voorraad te waarborgen.

Om veiligheidsredenen worden de inductieprocedures alleen uitgevoerd bij proefpersonen die op de dag van de inductie aan de volgende criteria voldoen: FEV1 ≥ 30% voorspeld, Geen voorgeschiedenis van > 5 ml bloedspuwing binnen 48 uur voorafgaand aan het bezoek, In staat om de procedure voor het opwekken van sputum. Merk op dat er weinig significant verschil is in de kwaliteit van het monster voor analyse tussen opgehoest en geïnduceerd sputum. Markers die moeten worden getest zoals eerder hierboven beschreven.

• Vragenlijst over blootstelling aan schimmels in de omgeving. Wordt uitgevoerd vóór het einde van het bezoek aan de kliniek. Deze vragenlijst is in zijn geheel een gevalideerde vragenlijst die wordt gebruikt door Dr. Andy Liu. Gezien de tijdsbeperkingen voor studiedeelnemers, gebruiken we een aangepaste vragenlijst gericht op vragen die geïnteresseerd zijn in deze studie (bijv. met betrekking tot blootstelling aan schimmels). Dit is niet gevalideerd, maar kan in deze pilootstudie belangrijke informatie opleveren voor toekomstig onderzoek

• Serum collectie. Perifere veneuze bloedafname zal worden uitgevoerd door een gecertificeerd persoon met behulp van de juiste steriele techniek door het CTRC. Monsters worden geëtiketteerd volgens de normen van het onderzoeksprotocol. Te testen merkers zijn hierboven beschreven.

  • Alle sputummonsters moeten worden opgeslagen en bewaard voor potentiële microbioom-, mycobioom- en transcriptoomanalyse, waarbij genexpressies worden beoordeeld die uniek zijn voor verschillende ontstekingsroutes.

Schattingen van de steekproefomvang: Het vermogen en de steekproefomvang voor het onderzoeksvoorstel staan ​​vast vanwege het verwachte aantal in aanmerking komende patiënten dat tijdens het studievenster voor deze pilotstudie zal worden gerekruteerd. Op basis van voorlopige gegevens en de beschreven definities van infectietypes, verwachten onderzoekers dat ze gedurende een rekruteringsperiode van 1 jaar ongeveer 10 personen zonder schimmelinfectie, 10 patiënten met een schimmelinfectie maar zonder ABPA en 5 met ABPA kunnen inschrijven. . Het primaire analyseplan richt zich op de beschrijving en vergelijking van de belangrijkste plasma- en sputummetingen beschreven in Tabel 3. Poweranalyse geeft de detecteerbare effectgroottes bij het vergelijken van de controle-arm (geen schimmelinfectie) met de niet-ABPA-groep of de ABPA-groep. Berekeningen zijn gebaseerd op een vermogen van 80% en een type I-foutpercentage van 0,05 voor tweezijdige twee-steekproeven gelijke variantie t-test uitgevoerd in PASS versie 15 statistische software (2). Groepssteekproefgroottes van 10 en 5 in de schimmelinfectiegroepen bereiken 80% vermogen om de nulhypothese van nul-effectgrootte te verwerpen wanneer de populatie-effectgrootte respectievelijk 1,36 en 1,66 is. Het onderzoek heeft dus een power van 80% om een ​​verschil in de te meten gemiddelde markers groter dan 1,66 en 1,32 standaarddeviaties te detecteren. Gezien de beperkte gegevens in de literatuur over Th2-markers bij CF, baseren we deze berekeningen op afwijkingen van een gemiddelde voor de meerdere Th2-markers die we testen.

Gegevensverzameling en -opslag: Alle proefpersonen worden geanonimiseerd bij het verzamelen van onderzoeksmonsters en opgeslagen met een hoofdsleutel. Er zal beperkte toegang zijn tot deze informatie met de PI en alleen essentiële onderzoeksmedewerkers die de gegevens kunnen controleren en bekijken. Alle papieren brondocumenten worden bewaard in een afgesloten archiefkast in de opslagfaciliteiten van het CF-onderzoeksteam. Om de gegevensintegriteit verder te waarborgen, worden de gegevens voor dit onderzoek bovendien opgeslagen in het Research Electronic Data Capture-systeem (REDCap), dat beperkte toegang tot alleen essentiële persoonlijke gegevens mogelijk maakt. REDCap maakt in-line validatie mogelijk om transcriptiefouten tot een minimum te beperken en biedt real-time meldingen van gegevensindiening en maakt directe centrale monitoring en feedback mogelijk. Toegang tot gegevens vereist een versleutelde SSL-verbinding (Secure Socket Layer) en wijzigingen worden geregistreerd door gebruikers-ID, tijdstempel en project. Van databases wordt regelmatig een back-up gemaakt.