Profili immunitari nell'infezione fungina CF

Mentre i batteri sono agenti predominanti nella malattia polmonare CF, i funghi sono spesso isolati sia nell'espettorato che nel liquido di lavaggio broncoalveolare (BAL), ma il loro ruolo nella CF non è completamente compreso. L'infezione fungina nella FC ha un ampio spettro di presentazioni, che variano dal rilevamento transitorio all'infezione persistente, bronchite fungina acuta con conseguente esacerbazione polmonare, sensibilizzazione agli allergeni fungini e aspergillosi broncopolmonare allergica (ABPA). Sebbene esistano linee guida cliniche per la diagnosi e il trattamento dell'ABPA nei pazienti con FC, ci sono poche linee guida e raccomandazioni riguardanti il ​​monitoraggio, l'assistenza clinica e il trattamento antimicotico nelle varie presentazioni della malattia fungina della FC; inoltre, l'impatto clinico dei funghi senza ABPA è poco conosciuto. Mentre l'infiammazione nella FC è classicamente considerata un processo guidato da neutrofili e macrofagi (Th1), è stato dimostrato che gli eosinofili e le citochine allergiche (Th2) sono elevate in presenza di malattia fungina in studi clinici e su animali. Gli studi hanno anche dimostrato una ridotta funzionalità polmonare (ad es. percentuale del volume espiratorio forzato previsto in un secondo, ppFEV1) in individui con frequente rilevamento di funghi nell'espettorato e associazioni con infezione da Pseudomonas e uso di antimicrobici. Gli adulti con FC sono anche più inclini alla sensibilizzazione fungina rispetto ai pazienti non CF, oltre ad avere tassi più elevati di rinite allergica e atopia. In uno studio retrospettivo condotto presso il nostro centro, abbiamo scoperto che i bambini con infezioni fungine intermittenti o croniche hanno sperimentato un declino più rapido della funzionalità polmonare rispetto a quelli senza infezioni fungine indipendentemente dallo stato ABPA (vedi dati preliminari). Capire se le infezioni fungine sono guidate da un processo infiammatorio allergico (Th2) può alterare gli approcci terapeutici utilizzando steroidi e terapie antimicotiche più prontamente nei pazienti con infezione fungina per combattere il declino della funzione polmonare. Studi limitati hanno indagato la frequenza della sensibilizzazione allergica ai patogeni fungini in individui con FC, la frequenza della sensibilizzazione allergica nella popolazione pediatrica CF in generale, e i profili infiammatori unici e i fenotipi delle infezioni fungine CF, sia nell'espettorato che nel siero.

Ipotesi: ipotizziamo che i bambini con FC e infezioni fungine senza ABPA avranno profili infiammatori allergici elevati e una maggiore sensibilizzazione agli elementi fungini rispetto a quelli senza infezione fungina.

Obiettivo specifico 1: Confrontare l'infiammazione Th2 in pazienti con e senza infezioni fungine in pazienti con CF e quelli con ABPA.

• Approccio: otterremo campioni di siero ed espettorato da 25 pazienti con (1) infezione fungina senza ABPA, n=10 (definita come ≥ due colture fungine positive nei 18 mesi precedenti), (2) nessuna infezione fungina, n=10, e (3) ABPA, n = 5, e misurare misurazioni specifiche dell'espettorato e delle citochine sieriche per valutare le vie infiammatorie Th2 e Th1.
• Biomarcatori misurati: proteina cationica eosinofila (ECP), interleuchina-4 (IL4), interleuchina-5 (IL5), interleuchina-10 (IL10), interleuchina-13 (IL13) e conta degli eosinofili sia nel siero che nell'espettorato.
• Risultato atteso: gli individui con infezione fungina senza APBA avranno marcatori di infiammazione Th2 elevati rispetto a quelli senza infezione fungina. Confronteremo anche quelli con ABPA come gruppo di controllo separato. Misureremo anche i marcatori Th1 da utilizzare come riferimento per i profili infiammatori precedentemente stabiliti visti nella FC, vedendo se quelli con malattia fungina deviano verso un processo più guidato da Th2.

Obiettivo specifico 2: Indagare la sensibilizzazione allergica agli elementi fungini nei pazienti con infezione fungina CF senza ABPA rispetto a quelli senza infezione fungina ea quelli con ABPA.

• Approccio: Verranno misurate le IgE totali e il test ImmunoCAP sierico dei livelli di IgE specifiche verso proteine ​​fungine di varie specie (Aspergillus, Candida, ecc.). per determinare la sensibilizzazione fungina. Indagheremo anche i pazienti per quanto riguarda le esposizioni ambientali per esplorare le relazioni con la sensibilizzazione allergica.
• Risultato atteso: gli individui con infezione fungina senza ABPA avranno maggiori probabilità di mostrare sensibilizzazione allergica agli elementi fungini rispetto a quelli senza infezione fungina.

I risultati di questo studio aiuteranno a caratterizzare il profilo infiammatorio associato alle infezioni fungine CF contribuendo alla comprensione della natura infettiva e allergica della malattia nella popolazione CF. Da questo, il contributo sia alla fisiopatologia che alle caratteristiche cliniche delle infezioni fungine CF servirà come passo verso la comprensione delle opzioni di gestione, delle linee guida per la cura e della progressione della malattia per questo insieme unico di organismi difficili da trattare.

Reclutamento: proponiamo di reclutare 25 pazienti con FC di età compresa tra 8 e 25 anni che accettino di partecipare a questo studio trasversale che esamina le caratteristiche del sistema immunitario dell'infezione fungina e dell'ABPA. Abbiamo in programma di esaminare le persone che vengono alla loro clinica di routine per la fibrosi cistica e avvicinarle riguardo al loro interesse a partecipare a questo studio. Da questo, spiegheremo il concetto, l'ipotesi e le procedure coinvolte con l'intento di programmarli per una visita di ricerca.

Selezione dei pazienti: i pazienti verranno reclutati dal Centro per la fibrosi cistica del CHCO da ricercatori dello studio o coordinatori di ricerca qualificati al momento di una visita clinica di routine.

Visita di studio: abbiamo in programma di reclutare in modo prospettico 25 soggetti con FC durante un periodo di stabilità clinica. I soggetti avranno una visita clinica di ricerca che coinciderà con la loro visita clinica presso le strutture della CHCO Pulmonary Clinic. Le seguenti informazioni diagnostiche verranno inserite nei moduli di segnalazione dei casi: informazioni demografiche, anamnesi diagnostica e mutazioni, comorbilità correlate alla fibrosi cistica, risultati microbiologici storici inclusi i risultati delle colture fungine, farmaci inclusa la terapia con modulatori e regimi antibiotici a lungo termine, precedenti test allergologici, criteri diagnostici per ABPA (se applicabile). Utilizzeremo anche i dati clinici storici della cartella clinica per stabilire altre comorbilità, tendenze della funzionalità polmonare e basale, anamnesi di altre infezioni batteriche, anamnesi di diagnosi di allergia e altra anamnesi medica pertinente e test diagnostici (ad es. precedenti risultati di scansioni TC, pregresse analisi del sangue, ecc.). Verranno effettuate le seguenti valutazioni:

• Dati storici nella cartella clinica. Gli esempi includono diagnosi di comorbilità correlate alla FC (come, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, diabete correlato a FC, malattie epatiche CF, asma, ecc.), esami del sangue precedenti (come, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, livelli sierici di IgE, precedenti test allergologici, dati di broncoscopia e studi di lavaggio, laboratori FC di routine e urgenti/ricoveri, ecc.), precedenti dati di spirometria e funzionalità polmonare, precedenti dati nutrizionali e di crescita (BMI, livelli vitaminici, ecc.), precedenti dati microbiologici e colturali, ecc.
• Misurazioni del BMI ottenute da una visita clinica regolare per la FC
• Altezza e peso da ricavare e successivamente calcolare.
• Test di funzionalità polmonare ottenuti da regolari visite cliniche per FC. La spirometria sarà eseguita secondo i criteri dell'American Thoracic Society, mentre i valori assoluti saranno convertiti in percentuale prevista utilizzando le equazioni di riferimento dell'iniziativa Global Lung Function34.
• Raccolta dell'espettorato. Verrà utilizzato il più possibile espettorato espettorato spontaneo. Questo verrà raccolto a casa dal paziente seguendo un regime di pulizia delle vie aeree respiratorie di routine entro 12 ore dalla visita clinica. Il campione verrà posto in una tazza per campioni spedita e posta sul ghiaccio e portato alla visita clinica. Se l'espettorato non può essere espettorato prima della visita, cercheremo di utilizzare l'espettorato rimanente che non viene utilizzato per esigenze cliniche per ulteriori analisi e conservazione. L'espettorato può essere raccolto mediante induzione dell'espettorato secondo l'attuale procedura operativa standard del CFF Therapeutics Development Network se 1) non è in grado di espettorare, (2) il paziente soddisfa i criteri clinici per l'induzione dell'espettorato e (3) la clinica è in grado di eseguire la ricerca sull'espettorato indotto in base all'attuale Linee guida COVID-19 per garantire la sicurezza dei membri del team e un'adeguata fornitura di DPI.

Per motivi di sicurezza, le procedure di induzione verranno eseguite solo per i soggetti che soddisfano i seguenti criteri il giorno dell'induzione: FEV1 ≥ 30% del predetto, nessuna storia di emottisi > 5 ml entro 48 ore prima della visita, in grado di tollerare il procedura di induzione dell'espettorato. Da notare, c'è poca differenza significativa nella qualità del campione per l'analisi tra espettorato espettorato e indotto. Marcatori da testare come precedentemente descritto sopra.

• Questionario sull'esposizione ai funghi ambientali. Verrà eseguito prima della fine della visita clinica. Questo questionario nella sua interezza è un questionario convalidato utilizzato dal Dr. Andy Liu. Dati i limiti di tempo per i partecipanti allo studio, stiamo utilizzando un questionario modificato incentrato sulle domande di interesse per questo studio (ad es. relativi all'esposizione ai funghi). Questo non è stato convalidato ma può fornire informazioni importanti in questo studio pilota per la ricerca futura

• Raccolta del siero. Il prelievo di sangue venoso periferico verrà eseguito da un individuo certificato utilizzando un'appropriata tecnica sterile dal CTRC. I campioni saranno etichettati secondo gli standard del protocollo di ricerca. Marcatori da testare descritti sopra.

  • Tutti i campioni di espettorato devono essere conservati e conservati per potenziali analisi di microbioma, micobioma e trascrittoma, valutando le espressioni geniche uniche per vari percorsi infiammatori.

Stime della dimensione del campione: la potenza e la dimensione del campione per la proposta di studio sono fisse a causa del numero previsto di pazienti idonei da reclutare in questo studio pilota durante la finestra dello studio. Sulla base dei dati preliminari e delle definizioni descritte dei tipi di infezione, i ricercatori prevedono che in una finestra di reclutamento di 1 anno saranno in grado di arruolare circa 10 individui senza infezione fungina, 10 pazienti con infezione fungina ma non ABPA e 5 con ABPA . Il piano di analisi primaria si concentra sulla descrizione e sul confronto delle misure chiave del plasma e dell'espettorato descritte nella Tabella 3. L'analisi della potenza fornisce le dimensioni dell'effetto rilevabili confrontando il braccio di controllo (nessuna infezione fungina) con il gruppo non-ABPA o con il gruppo ABPA. I calcoli si basano su una potenza dell'80% e un tasso di errore di tipo I di 0,05 per il test t di uguale varianza a due code a due code condotto nel software statistico PASS versione 15 (2). Le dimensioni del campione di gruppo di 10 e 5 nei gruppi di infezione fungina raggiungono l'80% di potere per rifiutare l'ipotesi nulla della dimensione dell'effetto zero quando la dimensione dell'effetto della popolazione è rispettivamente di 1,36 e 1,66. Pertanto, lo studio è potenziato all'80% per rilevare una differenza nei marcatori medi da misurare maggiore di 1,66 e 1,32 deviazioni standard. Dati i dati limitati in letteratura riguardanti i marcatori Th2 nella FC, stiamo basando questi calcoli sulle deviazioni da una media per i marcatori Th2 multipli che stiamo testando.

Raccolta e archiviazione dei dati: tutti i soggetti verranno anonimizzati al momento della raccolta del campione di studio e archiviati con una chiave master. Ci sarà un accesso limitato a queste informazioni con il PI e solo il personale di ricerca essenziale in grado di monitorare e visualizzare i dati. Tutti i documenti di origine cartacei saranno conservati in un archivio chiuso a chiave nelle strutture di archiviazione del team di ricerca sulla FC. Inoltre, per garantire ulteriormente l'integrità dei dati, i dati per questo studio saranno archiviati nel sistema di acquisizione elettronica dei dati di ricerca (REDCap), che consentirà un accesso limitato solo al personale essenziale. REDCap consente la convalida in linea per ridurre al minimo gli errori di trascrizione e fornisce notifiche in tempo reale dell'invio dei dati e consente il monitoraggio e il feedback centrali immediati. L'accesso ai dati richiede una connessione SSL (Secure Socket Layer) crittografata e le modifiche vengono registrate per ID utente, timestamp e progetto. I database vengono sottoposti a backup frequentemente.