Immuuniprofiilit CF-sieniinfektiossa

Vaikka bakteerit ovat hallitsevia tekijöitä CF-keuhkosairaudessa, sieniä eristetään usein sekä ysköksestä että bronkoalveolaarisesta huuhtelunesteestä (BAL), mutta niiden roolia CF:ssä ei täysin ymmärretä. CF:n sieni-infektiolla on laaja kirjo esitysmuotoja, jotka vaihtelevat ohimenevästä havaitsemisesta jatkuvaan infektioon, akuuttiin sieni-keuhkoputkentulehdukseen, josta seuraa keuhkojen paheneminen, herkistymisestä sieniallergeeneille ja allergiseen bronkopulmonaariseen aspergilloosiin (ABPA). Vaikka ABPA:n diagnosoimiseen ja hoitoon CF-potilailla on olemassa kliinisiä ohjeita, on olemassa vain vähän ohjeita ja suosituksia seurannasta, kliinisestä hoidosta ja sienilääkkeiden hoidosta CF-sienisairauksien eri muodoissa. Lisäksi sienten kliininen vaikutus ilman ABPA:ta on huonosti ymmärretty. Vaikka CF:n tulehdusta pidetään perinteisesti neutrofiilien ja makrofagien ohjaamana prosessina (Th1), eosinofiilien ja allergisten sytokiinien (Th2) on osoitettu lisääntyneen sienitautien esiintyessä sekä kliinisissä että eläinperäisissä CF-tutkimuksissa. Tutkimukset ovat myös osoittaneet heikentynyttä keuhkojen toimintaa (esim. prosentuaalinen ennustettu pakotettu uloshengitystilavuus sekunnissa, ppFEV1) henkilöillä, joiden ysköksessä havaitaan usein sieniä, ja joilla on yhteys Pseudomonas-infektioon ja mikrobilääkkeiden käyttöön. Aikuiset, joilla on CF, ovat myös alttiimpia sienien herkistymiselle verrattuna ei-CF-potilaisiin, ja heillä on enemmän allergista nuhaa ja atopiaa. Keskuksessamme tehdyssä retrospektiivisessä tutkimuksessa havaitsimme, että ajoittaista tai kroonista sieni-infektiota sairastavien lasten keuhkojen toiminta heikkeni nopeammin kuin niillä, joilla ei ollut sieni-infektioita ABPA-tilasta riippumatta (katso alustavat tiedot). Sen ymmärtäminen, johtuuko sieni-infektioista allerginen (Th2) tulehdusprosessi, voi muuttaa hoitomenetelmiä käyttämällä steroideja ja sienilääkkeitä helpommin potilailla, joilla on sieni-infektio keuhkojen toiminnan heikkenemisen torjumiseksi. Rajoitetut tutkimukset ovat tutkineet allergisen herkistymisen esiintyvyyttä sienipatogeeneille CF-potilailla, allergisen herkistymisen esiintymistiheyttä lasten CF-populaatiossa yleensä ja CF-sieni-infektioiden ainutlaatuisia tulehdusprofiileja ja fenotyyppejä sekä ysköksessä että seerumissa.

Hypoteesi: Oletamme, että lapsilla, joilla on CF ja sieni-infektio ilman ABPA:ta, on kohonneet allergiset tulehdusprofiilit ja lisääntynyt herkistyminen sienielementeille verrattuna niihin, joilla ei ole sieni-infektiota.

Erityinen tavoite 1: Vertaa Th2-tulehdusta potilailla, joilla on sieni-infektioita ja joilla ei ole CF-potilaita, ja potilailla, joilla on ABPA.

• Lähestymistapa: Otamme seerumi- ja yskösnäytteet 25 potilaalta, joilla on joko (1) sieni-infektio ilman ABPA:ta, n = 10 (määritelty ≥ kaksi positiivista sieniviljelmää edellisten 18 kuukauden aikana), (2) ei sieni-infektiota, n = 10, ja (3) ABPA, n = 5, ja mittaa spesifiset ysköksen ja seerumin sytokiinimittaukset Th2- ja Th1-tulehdusreittien arvioimiseksi.
• Mitatut biomarkkerit: Eosinofiilinen kationinen proteiini (ECP), Interleukiini-4 (IL4), Interleukiini-5 (IL5), Interleukiini-10 (IL10), Interleukiini-13 (IL13) ja eosinofiilien määrä sekä seerumissa että ysköksessä.
• Odotettu tulos: Yksilöillä, joilla on sieni-infektio ilman APBA:ta, on kohonneet Th2-tulehduksen markkerit verrattuna henkilöihin, joilla ei ole sieni-infektiota. Vertaamme myös niihin, joissa ABPA on erillisenä kontrolliryhmänä. Mittaamme myös Th1-markkereita, joita käytetään viitteenä aiemmin vakiintuneisiin CF:ssä havaittuihin tulehdusprofiileihin, jotta nähdään, poikkeavatko sienitauteja sairastavat kohti enemmän Th2-ohjattua prosessia.

Erityistavoite 2: Tutkia allergista herkistymistä sienielementeille potilailla, joilla on CF-sieni-infektio ilman ABPA:ta verrattuna potilaisiin, joilla ei ole sieni-infektiota, ja potilaisiin, joilla on ABPA.

• Lähestymistapa: Mittaamme eri lajien sieniproteiinien (Aspergillus, Candida jne.) spesifisten IgE-tasojen kokonais-IgE:n ja seerumin ImmunoCAP-testauksen. sieniherkistymisen määrittämiseksi. Tutkimme myös potilaita ympäristöaltistumisesta selvittääksemme yhteyksiä allergiseen herkistymiseen.
• Odotettu tulos: Yksilöt, joilla on sieni-infektio ilman ABPA:ta, osoittavat todennäköisemmin allergista herkistymistä sienielementeille verrattuna henkilöihin, joilla ei ole sieni-infektiota.

Tämän tutkimuksen tulokset auttavat karakterisoimaan CF-sieni-infektioihin liittyvää tulehdusprofiilia, mikä auttaa ymmärtämään sekä taudin tarttuvaa että allergista luonnetta CF-populaatiossa. Tämän perusteella panos CF-sieni-infektioiden patofysiologiaan ja kliinisiin ominaisuuksiin toimii askeleena kohti tämän ainutlaatuisen vaikeasti hoidettavien organismien hoitovaihtoehtojen, hoito-ohjeiden ja taudin etenemisen ymmärtämistä.

Rekrytointi: Ehdotamme, että rekrytoidaan 25 CF-potilasta, joiden ikä on 8–25 vuotta ja jotka suostuvat osallistumaan tähän poikkileikkaustutkimukseen, jossa tarkastellaan sieni-infektion ja ABPA:n immuunijärjestelmän ominaisuuksia. Aiomme seuloa henkilöitä, jotka tulevat heidän rutiininomaiselle CF-klinikalleen, ja lähestymme heitä heidän kiinnostuksensa osallistua tähän tutkimukseen. Tämän perusteella selitämme käsitteen, hypoteesin ja menettelyt, jotka liittyvät tarkoitukseen ajoittaa ne tutkimusvierailua varten.

Potilaiden valinta: Tutkijat tai pätevät tutkimuskoordinaattorit rekrytoivat potilaat CHCO:n CF-keskuksesta rutiininomaisen klinikkakäynnin yhteydessä.

Opintokäynti: Suunnittelemme rekrytoivamme 25 CF-potilasta kliinisen vakauden aikana. Koehenkilöillä on yksi tutkimusklinikalla käynti, joka osuu samaan aikaan heidän CHCO:n keuhkoklinikalla käynnin kanssa. Seuraavat diagnostiset tiedot syötetään tapausraporttilomakkeille: demografiset tiedot, diagnostinen historia ja mutaatiot, CF:ään liittyvät rinnakkaissairaudet, historialliset mikrobiologian tulokset, mukaan lukien sieniviljelytulokset, lääkkeet mukaan lukien modulaattorihoito ja pitkäaikaiset antibioottiohjelmat, aiemmat allergiatestit, ABPA:n diagnostiset kriteerit (jos sovellettavissa). Hyödynnämme myös historiallisia kliinisiä tietoja sairauskertomuksesta muiden samanaikaisten sairauksien, keuhkojen toimintatrendien ja lähtötilanteen, muiden bakteeri-infektioiden historian, allergiadiagnoosien ja muiden asiaankuuluvien sairaushistorian ja diagnostisten tutkimusten (esim. aiempien TT-tutkimusten, aikaisempi verikoe jne.). Seuraavat arvioinnit suoritetaan:

• Historialliset tiedot sairauskertomuksessa. Esimerkkejä ovat CF:ään liittyvät rinnakkaissairaudet (kuten CF-aiheinen diabetes, CF-maksasairaus, astma jne.), aikaisemmat verikokeet (kuten seerumin IgE-tasot, mutta niihin rajoittumatta, aikaisemmat allergiatestit, bronkoskoopiatiedot ja huuhtelututkimukset, rutiini- ja kiireelliset CF-laboratoriot jne.), aiemmat spirometria- ja keuhkojen toimintatiedot, aiemmat ravitsemus- ja kasvutiedot (BMI, vitamiinitasot jne.), aiemmat mikrobiologia- ja viljelytiedot jne.
• BMI-mittaukset, jotka on saatu säännöllisestä CF-klinikallakäynnistä
• Pituus ja paino saadaan ja lasketaan myöhemmin.
• Keuhkojen toimintatestit, jotka on saatu säännöllisestä CF-klinikalla käynnistä. Spirometria suoritetaan American Thoracic Societyn kriteerien mukaisesti, kun taas absoluuttiset arvot muunnetaan prosentteiksi, jotka on ennustettu käyttämällä Global Lung Function -aloitteen viiteyhtälöitä34.
• Yskösten kerääminen. Spontaanisti yskättyä ysköstä käytetään mahdollisuuksien mukaan. Potilas kerää sen kotona tavanomaisen hengitysteiden puhdistuksen jälkeen 12 tunnin sisällä klinikalla käynnistä. Näyte laitetaan postitettuun näytekuppiin ja asetetaan jäälle ja tuodaan klinikkakäynnille. Jos ysköstä ei voida erottaa ennen käyntiä, yritämme hyödyntää jäljellä olevan ysköksen, jota ei käytetä kliinisiin tarpeisiin lisäanalyysiin ja varastointiin. Ysköstä voidaan kerätä ysköksen induktiolla nykyisen CFF Therapeutics Development Network -standardin toimintaohjeen mukaisesti, jos 1) ei pysty yskäilemään, (2) potilas täyttää kliiniset kriteerit ysköksen induktiolle ja (3) klinikka pystyy suorittamaan tutkimuksen aiheuttamaa ysköstä nykyisten tietojen perusteella. COVID-19-ohjeet varmistamaan tiimin jäsenten turvallisuus ja riittävät henkilönsuojaimet.

Turvallisuussyistä induktiotoimenpiteet suoritetaan vain henkilöille, jotka täyttävät seuraavat kriteerit induktiopäivänä: FEV1 ≥ 30 % ennustettu, ei historiaa > 5 ml hemoptysis 48 tunnin aikana ennen käyntiä, kykenee sietämään ysköksen induktiomenettely. On huomattava, että yskän ja indusoidun ysköksen välillä on vain vähän merkittävää eroa analyysinäytteiden laadussa. Markkerit testataan edellä kuvatulla tavalla.

• Ympäristön sienialtistuskyselylomake. Suoritetaan ennen klinikkakäynnin päättymistä. Tämä kyselylomake kokonaisuudessaan on tohtori Andy Liun käyttämä validoitu kyselylomake. Koska tutkimukseen osallistuneilla on aikarajoitteita, käytämme muokattua kyselylomaketta, joka keskittyy tätä tutkimusta kiinnostaviin kysymyksiin (esim. jotka liittyvät sienialtistumiseen). Tätä ei ole validoitu, mutta se voi tarjota tärkeää tietoa tässä pilottitutkimuksessa tulevaa tutkimusta varten

• Seerumikokoelma. Sertifioitu henkilö ottaa perifeerisen laskimoveren käyttämällä asianmukaista steriiliä tekniikkaa CTRC:ssä. Näytteet merkitään tutkimusprotokollastandardien mukaisesti. Edellä kuvatut testattavat merkit.

  • Kaikki yskösnäytteet tallennetaan ja tallennetaan mahdollisia mikrobiomi-, mykobiomi- ja transkriptioanalyysiä varten, jotta voidaan arvioida erilaisten tulehdusreittien ainutlaatuisia geeniekspressioita.

Otoskokoarviot: Tutkimusehdotuksen teho ja otoskoko ovat kiinteät, koska tähän pilottitutkimukseen tutkimusikkunan aikana otetaan mukaan odotettavissa oleva määrä kelvollisia potilaita. Alustavien tietojen ja kuvattujen infektiotyyppien määritelmien perusteella tutkijat arvioivat, että he voivat yhden vuoden rekrytointiikkunan aikana rekisteröidä noin 10 potilasta, joilla ei ole sieni-infektiota, 10 potilasta, joilla on sieni-infektio, mutta ei ABPA:ta, ja 5 potilasta, joilla on ABPA. . Ensisijainen analyysisuunnitelma keskittyy tärkeimpien plasma- ja yskösmittausten kuvaukseen ja vertailuun, jotka on kuvattu taulukossa 3. Tehoanalyysi tarjoaa havaittavissa olevat vaikutusten koot verrattaessa kontrollihaaraa (ei sieni-infektiota) joko ei-ABPA- tai ABPA-ryhmään. Laskelmat perustuvat 80 %:n potenssiin ja tyypin I virhesuhteeseen 0,05 kaksipuoliselle kaksiotoksiselle tasavarianssin t-testille, joka on suoritettu PASS-versiolla 15 tilastoohjelmistolla (2). Ryhmäotoskoot 10 ja 5 sieni-infektioryhmissä saavuttavat 80 %:n tehon hylätä nollavaikutuksen koon nollahypoteesi, kun populaatiovaikutuksen koko on vastaavasti 1,36 ja 1,66. Siten tutkimusta tehostetaan 80 %:lla mittaavien keskimääräisten markkerien eron havaitsemiseksi, joka on suurempi kuin 1,66 ja 1,32 standardipoikkeama. Koska kirjallisuudessa on vain vähän tietoja Th2-markkereista CF:ssä, perustamme nämä laskelmat useiden testaamiemme Th2-markkerien keskiarvosta poikkeamiin.

Tiedonkeruu ja tallennus: Kaikkien koehenkilöiden tunniste poistetaan tutkimusnäytteiden keräämisen yhteydessä ja tallennetaan yleisavaimella. PI:llä on rajoitettu pääsy näihin tietoihin ja vain keskeinen tutkimushenkilöstö voi seurata ja tarkastella tietoja. Kaikki paperiversiot lähdeasiakirjat säilytetään lukitussa arkistokaapissa CF-tutkimusryhmän varastotiloissa. Lisäksi tietojen eheyden varmistamiseksi tämän tutkimuksen tiedot tallennetaan Research Electronic Data Capture -järjestelmään (REDCap), joka mahdollistaa rajoitetun pääsyn vain välttämättömiin henkilökohtaisiin tietoihin. REDCap mahdollistaa in-line-validoinnin transkriptiovirheiden minimoimiseksi ja tarjoaa reaaliaikaisia ​​ilmoituksia tietojen toimittamisesta ja mahdollistaa välittömän keskitetyn seurannan ja palautteen. Pääsy tietoihin vaatii salatun SSL-yhteyden ja muutokset kirjataan käyttäjätunnuksen, aikaleiman ja projektin mukaan. Tietokannat varmuuskopioidaan usein.