Immunprofiler vid CF-svampinfektion

Även om bakterier är dominerande medel vid CF-lungsjukdom, isoleras svampar ofta i både sputum och bronkoalveolär sköljvätska (BAL), men deras roll i CF är inte helt klarlagd. Svampinfektion vid CF har ett brett spektrum av presentationer, som varierar från övergående upptäckt till ihållande infektion, akut svampbronkit med resulterande pulmonell exacerbation, sensibilisering för svampallergener och allergisk bronkopulmonell aspergillos (ABPA). Även om det finns kliniska riktlinjer för diagnos och behandling av ABPA hos patienter med CF, finns det få riktlinjer och rekommendationer angående övervakning, klinisk vård och antifungal behandling i de olika presentationerna av CF-svampsjukdom; vidare är den kliniska effekten av svampar utan ABPA dåligt förstådd. Medan inflammation i CF klassiskt anses vara en neutrofil- och makrofagdriven process (Th1), har eosinofiler och allergiska cytokiner (Th2) visat sig vara förhöjda i närvaro av svampsjukdom i både kliniska och djur-CF-studier. Studier har också visat nedsatt lungfunktion (t. procent förutspådd forcerad utandningsvolym på en sekund, ppFEV1) hos individer med frekvent svampdetektering i sputum och samband med Pseudomonas-infektion och användning av antimikrobiella medel. Vuxna med CF är också mer benägna att få svampsensibilisering jämfört med icke-CF-patienter samt har högre frekvens av allergisk rinit och atopi. I en retrospektiv studie utförd på vårt center fann vi att barn med intermittenta eller kroniska svampinfektioner upplevde snabbare försämring av lungfunktionen jämfört med de utan svampinfektioner oavsett ABPA-status (se preliminära data). Att förstå huruvida svampinfektioner drivs av en allergisk (Th2) inflammatorisk process kan förändra behandlingsmetoder genom att använda steroider och svampdödande terapier lättare hos patienter med svampinfektion för att bekämpa försämrad lungfunktion. Begränsade studier har undersökt frekvensen av allergisk sensibilisering mot svamppatogener hos individer med CF, frekvensen av allergisk sensibilisering i den pediatriska CF-populationen i allmänhet och de unika inflammatoriska profilerna och fenotyperna av CF-svampinfektioner, både i sputum och serum.

Hypotes: Vi antar att barn med CF och svampinfektioner utan ABPA kommer att ha förhöjda allergiska inflammatoriska profiler och ökad sensibilisering mot svampelement jämfört med de utan svampinfektion.

Specifikt mål 1: Jämför Th2-inflammation hos patienter med och utan svampinfektioner hos patienter med CF och med de med ABPA.

• Tillvägagångssätt: Vi kommer att erhålla serum- och sputumprover från 25 patienter med antingen (1) svampinfektion utan ABPA, n=10 (definierad som ≥ två positiva svampkulturer under tidigare 18 månader), (2) ingen svampinfektion, n=10, och (3) ABPA, n=5, och mät specifika sputum- och serumcytokinmätningar för att utvärdera Th2- och Th1-inflammatoriska vägar.
• Uppmätta biomarkörer: Eosinofilt katjoniskt protein (ECP), Interleukin-4 (IL4), Interleukin-5 (IL5), Interleukin-10 (IL10), Interleukin-13 (IL13) och eosinofilantal i både serum och sputum.
• Förväntat resultat: Individer med svampinfektion utan APBA kommer att ha förhöjda Th2-markörer för inflammation jämfört med de utan svampinfektion. Vi kommer också att jämföra med de med ABPA som en separat kontrollgrupp. Vi kommer också att mäta Th1-markörer som ska användas som referens till tidigare etablerade inflammatoriska profiler som ses vid CF, för att se om de med svampsjukdom avviker mot en mer Th2-driven process.

Specifikt mål 2: Undersök allergisk sensibilisering mot svampelement hos patienter med CF-svampinfektion utan ABPA jämfört med de utan svampinfektion och till de med ABPA.

• Tillvägagångssätt: Vi kommer att mäta total IgE och serum ImmunoCAP-testning av specifika IgE-nivåer till svampproteiner av olika arter (Aspergillus, Candida, etc). för att bestämma svampsensibilisering. Vi kommer också att kartlägga patienter angående miljöexponeringar för att utforska samband med allergisk sensibilisering.
• Förväntat resultat: Individer med svampinfektion utan ABPA kommer att vara mer benägna att visa allergisk sensibilisering mot svampelement jämfört med de utan svampinfektion.

Resultaten av denna studie kommer att hjälpa till att karakterisera den inflammatoriska profilen associerad med CF-svampinfektioner, vilket bidrar till förståelsen av både den infektiösa och allergiska karaktären av sjukdom i CF-populationen. Från detta kommer bidraget till både patofysiologin och de kliniska egenskaperna hos CF-svampinfektioner att fungera som ett steg mot att förstå hanteringsalternativ, vårdriktlinjer och sjukdomsprogression för denna unika uppsättning svårbehandlade organismer.

Rekrytering: Vi föreslår att rekrytera 25 patienter med CF i åldern 8 till 25 år som samtycker till att delta i denna tvärsnittsstudie som tittar på immunsystemets egenskaper hos svampinfektion och ABPA. Vi planerar att screena individer som kommer till deras rutinmässiga CF-klinik och kontakta dem angående deras intresse av att delta i denna studie. Utifrån detta kommer vi att förklara konceptet, hypotesen och procedurerna som är involverade med avsikt att schemalägga dem för ett forskningsbesök.

Patienturval: Patienter kommer att rekryteras från CF-centret vid CHCO av studieutredare eller kvalificerade forskningskoordinatorer vid tidpunkten för ett rutinmässigt klinikbesök.

Studiebesök: Vi planerar att prospektivt rekrytera 25 försökspersoner med CF under en period av klinisk stabilitet. Försökspersonerna kommer att ha ett forskningsklinikbesök som sammanfaller med deras klinikbesök på CHCO lungklinik. Följande diagnostisk information kommer att föras in på fallrapportformulär: demografisk information, diagnostisk historia och mutationer, CF-relaterade komorbiditeter, historiska mikrobiologiska resultat inklusive svampodlingsresultat, mediciner inklusive modulatorterapi och långtidsantibiotikakurer, tidigare allergitestning, diagnostiska kriterier för ABPA (om tillämpligt). Vi kommer också att använda historiska kliniska data från journalen för att fastställa andra samsjukligheter, lungfunktionstrender och baslinje, historia av andra bakteriella infektioner, historia av allergidiagnoser och annan relevant medicinsk historia och diagnostiska tester (dvs tidigare resultat av CT-skanning, tidigare blodprov etc.). Följande utvärderingar kommer att göras:

• Historiska uppgifter i journalen. Exempel inkluderar komorbida diagnoser relaterade till CF (såsom men inte begränsat till CF-relaterad diabetes, CF-leversjukdom, astma, etc), tidigare blodprov (såsom men inte begränsat till serum-IgE-nivåer, tidigare allergitester, bronkoskopidata och sköljningsstudier, rutin- och akut-/intagnings-CF-labb, etc), tidigare spirometer- och lungfunktionsdata, tidigare närings- och tillväxtdata (BMI, vitaminnivåer etc), tidigare mikrobiologi och odlingsdata, etc.
• BMI-mätningar erhållna från regelbundna CF-klinikbesök
• Höjd och vikt ska erhållas och därefter beräknas.
• Lungfunktionsundersökning erhållen från regelbundna CF-klinikbesök. Spirometri kommer att utföras enligt American Thoracic Society-kriterier, medan absoluta värden kommer att omvandlas till procent som förutspås med hjälp av Global Lung Function-initiativets referensekvationer34.
• Sputum samling. Spontant upphostad sputum kommer att användas i möjligaste mån. Detta kommer att samlas upp hemma av patienten efter en rutinbehandling av andningsluftvägarna inom 12 timmar efter klinikbesöket. Provet kommer att placeras i en postad provbägare och placeras på is och tas med till klinikbesöket. Om sputum inte kan slemmas före besöket kommer vi att försöka använda återstående sputum UPPHOSTAT som inte används för kliniska behov för vidare analys och lagring. Sputum kan samlas in genom sputuminduktion enligt den nuvarande CFF Therapeutics Development Networks standardoperativa procedur om 1) inte kan upphosta, (2) patienten uppfyller kliniska kriterier för sputuminduktion och (3) kliniken kan utföra forskningsinducerat sputum baserat på nuvarande Covid-19-riktlinjer för att säkerställa teammedlemmens säkerhet och tillräcklig tillgång till skyddsutrustning.

Av säkerhetsskäl kommer induktionsprocedurerna endast att utföras för försökspersoner som uppfyller följande kriterier på induktionsdagen: FEV1 ≥ 30 % förutspått, Ingen historia av > 5 ml hemoptys inom 48 timmar före besöket, Kan tolerera sputuminduktionsprocedur. Notera att det finns liten signifikant skillnad i provkvalitet för analys mellan upphostat och inducerat sputum. Markörer som ska testas enligt tidigare beskrivning ovan.

• Enkät för miljösvampexponering. Kommer att utföras innan klinikbesöket avslutas. Detta frågeformulär i sin helhet är ett validerat frågeformulär som används av Dr. Andy Liu. Med tanke på tidsbegränsningar för studiedeltagare använder vi ett modifierat frågeformulär fokuserat på frågor som är intresserade av denna studie (t. som hänför sig till svampexponering). Detta har inte validerats men kan ge viktig information i denna pilotstudie för framtida forskning

• Serum samling. Perifer venös blodtagning kommer att utföras av certifierad person med lämplig steril teknik av CTRC. Proverna kommer att märkas enligt forskningsprotokollstandarder. Markörer som ska testas beskrivs ovan.

  • Alla sputumprover ska samlas och sparas för potentiell mikrobiom-, mykobiom- och transkriptomanalys, bedömning av genuttryck som är unika för olika inflammatoriska vägar.

Uppskattningar av provstorlek: Kraft och urvalsstorlek för studieförslaget är fasta på grund av det förväntade antalet kvalificerade patienter som ska rekryteras till denna pilotstudie under studiefönstret. Baserat på preliminära data och de beskrivna definitionerna av infektionstyper, förutser utredarna att de under ett 1-årigt rekryteringsfönster kommer att kunna registrera cirka 10 personer utan svampinfektion, 10 patienter med svampinfektion men inte ABPA och 5 med ABPA . Den primära analysplanen fokuserar på beskrivningen och jämförelsen av viktiga plasma- och sputummått som beskrivs i Tabell 3. Effektanalys ger de detekterbara effektstorlekarna när man jämför kontrollarmen (ingen svampinfektion) med antingen icke-ABPA-gruppen eller ABPA-gruppen. Beräkningarna är baserade på en styrka på 80 % och en typ I-felfrekvens på 0,05 för tvåsidigt tvåsidigt t-test med lika varians med två sampel utfört i PASS version 15 statistisk programvara (2). Gruppprovstorlekar på 10 och 5 i svampinfektionsgrupperna uppnår 80 % förmåga att förkasta nollhypotesen om nolleffektstorlek när populationseffektstorleken är 1,36 respektive 1,66. Således drivs studien på 80 % för att detektera en skillnad i medelmarkörerna som ska mätas större än 1,66 och 1,32 standardavvikelser. Med tanke på begränsade data i litteraturen om Th2-markörer i CF, baserar vi dessa beräkningar på avvikelser från ett medelvärde för de multipla Th2-markörer vi testar.

Datainsamling och lagring: Alla försökspersoner kommer att avidentifieras vid insamling av studieprov och lagras med en huvudnyckel. Det kommer att vara begränsad tillgång till denna information med PI och endast viktig forskningspersonal som kan övervaka och se data. Alla papperskopior kommer att förvaras i ett låst arkivskåp i CF-forskargruppens förvaringsutrymmen. Dessutom, för att ytterligare säkerställa dataintegriteten, kommer data för denna studie att lagras i Research Electronic Data Capture-systemet (REDCap), vilket kommer att tillåta begränsad tillgång till endast väsentliga personliga. REDCap möjliggör in-line validering för att minimera transkriptionsfel och ger realtidsmeddelanden om datainlämning och möjliggör omedelbar central övervakning och feedback. Tillgång till data kräver en krypterad SSL-anslutning (Secure Socket Layer) och ändringar loggas med användar-ID, tidsstämpel och projekt. Databaser säkerhetskopieras ofta.