Profile immunologiczne w zakażeniu grzybiczym mukowiscydozy

Podczas gdy bakterie są głównymi czynnikami wywołującymi mukowiscydozę płuc, grzyby są często izolowane zarówno z plwociny, jak i płynu z popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych (BAL), jednak ich rola w mukowiscydozie nie jest w pełni poznana. Zakażenie grzybicze w mukowiscydozie ma szerokie spektrum objawów, od przejściowego wykrycia do przetrwałego zakażenia, ostrego grzybiczego zapalenia oskrzeli z wynikającym z tego zaostrzeniem płuc, uczulenia na alergeny grzybowe i alergicznej aspergilozy oskrzelowo-płucnej (ABPA). Chociaż istnieją wytyczne kliniczne dotyczące rozpoznawania i leczenia ABPA u pacjentów z mukowiscydozą, istnieje niewiele wytycznych i zaleceń dotyczących monitorowania, opieki klinicznej i leczenia przeciwgrzybiczego w różnych postaciach choroby grzybiczej mukowiscydozy; ponadto wpływ kliniczny grzybów bez ABPA jest słabo poznany. Podczas gdy zapalenie w CF jest klasycznie uważane za proces napędzany przez neutrofile i makrofagi (Th1), wykazano, że eozynofile i cytokiny alergiczne (Th2) są podwyższone w obecności choroby grzybiczej zarówno w badaniach klinicznych, jak i na zwierzętach. Badania wykazały również zmniejszoną czynność płuc (np. procent przewidywanej natężonej objętości wydechowej w ciągu jednej sekundy, ppFEV1) u osób z częstym wykrywaniem grzybów w plwocinie oraz powiązaniami z zakażeniem Pseudomonas i stosowaniem środków przeciwdrobnoustrojowych. Dorośli z mukowiscydozą są również bardziej podatni na uczulenie grzybicze w porównaniu z pacjentami bez mukowiscydozy, a także mają wyższy wskaźnik alergicznego nieżytu nosa i atopii. W badaniu retrospektywnym przeprowadzonym w naszym ośrodku stwierdziliśmy, że dzieci z okresowymi lub przewlekłymi infekcjami grzybiczymi doświadczały szybszego pogorszenia czynności płuc w porównaniu z dziećmi bez infekcji grzybiczych, niezależnie od statusu ABPA (patrz dane wstępne). Zrozumienie, czy infekcje grzybicze są spowodowane alergicznym (Th2) procesem zapalnym, może zmienić podejście do leczenia poprzez łatwiejsze stosowanie steroidów i terapii przeciwgrzybiczych u pacjentów z infekcją grzybiczą w celu zwalczania pogorszenia czynności płuc. W ograniczonych badaniach oceniano częstość uczulenia na patogeny grzybicze u osób z mukowiscydozą, ogólną częstość uczulenia alergicznego w populacji dzieci z mukowiscydozą oraz unikalne profile zapalne i fenotypy zakażeń grzybiczych mukowiscydozy, zarówno w plwocinie, jak i w surowicy.

Hipoteza: Stawiamy hipotezę, że dzieci z mukowiscydozą i zakażeniami grzybiczymi bez ABPA będą miały podwyższone profile alergicznego zapalenia i zwiększoną wrażliwość na elementy grzybicze w porównaniu z dziećmi bez zakażenia grzybiczego.

Cel szczegółowy 1: Porównanie stanu zapalnego Th2 u pacjentów z i bez infekcji grzybiczych u pacjentów z mukowiscydozą iz pacjentami z ABPA.

• Podejście: Pobierzemy próbki surowicy i plwociny od 25 pacjentów z (1) zakażeniem grzybiczym bez ABPA, n=10 (zdefiniowane jako ≥ dwa pozytywne posiewy grzybów w ciągu ostatnich 18 miesięcy), (2) bez zakażenia grzybiczego, n=10, oraz (3) ABPA, n=5, i zmierzyć swoiste pomiary cytokin w plwocinie i surowicy w celu oceny szlaków zapalnych Th2 i Th1.
• Zmierzono biomarkery: eozynofilowe białko kationowe (ECP), interleukina-4 (IL4), interleukina-5 (IL5), interleukina-10 (IL10), interleukina-13 (IL13) oraz liczba eozynofili w surowicy i plwocinie.
• Oczekiwany wynik: Osoby z infekcją grzybiczą bez APBA będą miały podwyższone markery stanu zapalnego Th2 w porównaniu z osobami bez infekcji grzybiczej. Porównamy również z tymi z ABPA jako oddzielną grupą kontrolną. Zmierzymy również markery Th1, które będą użyte jako odniesienie do wcześniej ustalonych profili zapalnych obserwowanych w mukowiscydozie, sprawdzając, czy osoby z chorobą grzybiczą odbiegają w kierunku procesu bardziej napędzanego przez Th2.

Cel szczegółowy 2: Zbadanie uczulenia alergicznego na elementy grzybicze u pacjentów z zakażeniem grzybiczym mukowiscydozy bez ABPA w porównaniu z pacjentami bez zakażenia grzybiczego iz pacjentami z ABPA.

• Podejście: Zmierzymy całkowite IgE i testy ImmunoCAP w surowicy na specyficzne poziomy IgE dla białek grzybów różnych gatunków (Aspergillus, Candida, itp.). w celu określenia uczulenia na grzyby. Przeprowadzimy również ankietę wśród pacjentów pod kątem narażenia środowiskowego, aby zbadać związek z uczuleniem alergicznym.
• Oczekiwany wynik: Osoby z zakażeniem grzybiczym bez ABPA będą bardziej narażone na uczulenie na elementy grzybicze w porównaniu z osobami bez zakażenia grzybiczego.

Wyniki tego badania pomogą scharakteryzować profil zapalny związany z infekcjami grzybiczymi mukowiscydozy, przyczyniając się do zrozumienia zarówno zakaźnego, jak i alergicznego charakteru choroby w populacji chorych na mukowiscydozę. Dzięki temu wkład zarówno w patofizjologię, jak i charakterystykę kliniczną zakażeń grzybiczych mukowiscydozy posłuży jako krok w kierunku zrozumienia opcji zarządzania, wytycznych dotyczących opieki i postępu choroby w przypadku tego wyjątkowego zestawu trudnych do leczenia organizmów.

Rekrutacja: Proponujemy rekrutację 25 pacjentów z mukowiscydozą w wieku od 8 do 25 lat, którzy wyrażą zgodę na udział w tym przekrojowym badaniu dotyczącym charakterystyki układu odpornościowego infekcji grzybiczych i ABPA. Planujemy przeprowadzić badania przesiewowe osób przychodzących do ich rutynowej kliniki mukowiscydozy i skontaktować się z nimi w sprawie zainteresowania udziałem w tym badaniu. Na tej podstawie wyjaśnimy koncepcję, hipotezę i procedury związane z zamiarem zaplanowania ich na wizytę badawczą.

Selekcja pacjentów: Pacjenci będą rekrutowani z Centrum CF w CHCO przez badaczy lub wykwalifikowanych koordynatorów badań w czasie rutynowej wizyty w klinice.

Wizyta studyjna: Planujemy prospektywną rekrutację 25 pacjentów z mukowiscydozą w okresie stabilizacji klinicznej. Pacjenci będą mieli jedną wizytę w klinice badawczej, która zbiegnie się z wizytą w klinice CHCO Pulmonary Clinic. Następujące informacje diagnostyczne zostaną wprowadzone do formularzy zgłoszeń przypadków: dane demograficzne, historia diagnostyczna i mutacje, choroby współistniejące związane z mukowiscydozą, historyczne wyniki mikrobiologiczne, w tym wyniki posiewów grzybów, leki, w tym terapia modulatorowa i długoterminowe schematy antybiotykowe, wcześniejsze testy alergiczne, kryteria diagnostyczne ABPA (jeśli dotyczy). Wykorzystamy również historyczne dane kliniczne z dokumentacji medycznej w celu ustalenia innych chorób współistniejących, trendów czynności płuc i wartości wyjściowych, historii innych infekcji bakteryjnych, historii rozpoznań alergii oraz innych istotnych historii medycznych i badań diagnostycznych (tj. poprzednich wyników tomografii komputerowej, poprzednie badania krwi itp.). Przeprowadzone zostaną następujące oceny:

• Dane historyczne w dokumentacji medycznej. Przykłady obejmują współistniejące rozpoznania związane z mukowiscydozą (takie jak między innymi cukrzyca związana z mukowiscydozą, choroba wątroby mukowiscydozy, astma itp.), wcześniejsze badania krwi (takie jak między innymi poziomy IgE w surowicy, wcześniejsze testy alergiczne, dane z bronchoskopii i badania płukania, rutynowe i pilne/przyjęcia laboratoria CF itp.), poprzednie dane spirometrii i czynności płuc, poprzednie dane żywieniowe i dotyczące wzrostu (BMI, poziom witamin itp.), poprzednie dane mikrobiologiczne i hodowlane itp.
• Pomiary BMI uzyskane podczas regularnych wizyt w poradni CF
• Wzrost i wagę, które należy uzyskać, a następnie obliczyć.
• Badanie funkcji płuc uzyskane podczas regularnej wizyty w poradni CF. Spirometria zostanie przeprowadzona zgodnie z kryteriami Amerykańskiego Towarzystwa Chorób Klatki Piersiowej, natomiast wartości bezwzględne zostaną przeliczone na przewidywane wartości procentowe przy użyciu równań referencyjnych inicjatywy Global Lung Function34.
• Kolekcja plwociny. W miarę możliwości zostanie wykorzystana samoistnie odkrztuszona plwocina. Zostanie ona pobrana w domu przez pacjenta zgodnie z rutynowym schematem oczyszczania dróg oddechowych w ciągu 12 godzin przed wizytą w klinice. Próbka zostanie umieszczona w wysłanym pocztą pojemniku na próbki, umieszczona w lodzie i przywieziona na wizytę w klinice. Jeśli plwociny nie da się odkrztusić przed wizytą, spróbujemy wykorzystać pozostałą odkrztuszoną plwocinę, która nie jest wykorzystywana do potrzeb klinicznych, do dalszej analizy i przechowywania. Plwocinę można pobrać przez indukcję plwociny zgodnie z aktualną standardową procedurą operacyjną CFF Therapeutics Development Network, jeśli 1) nie jest w stanie odkrztusić, (2) pacjent spełnia kryteria kliniczne indukcji plwociny oraz (3) klinika jest w stanie przeprowadzić badanie indukowanej plwociny w oparciu o aktualne Wytyczne COVID-19 w celu zapewnienia bezpieczeństwa członka zespołu i odpowiedniego zaopatrzenia w środki ochrony indywidualnej.

Ze względów bezpieczeństwa zabiegi indukcji będą wykonywane tylko u osób, które w dniu indukcji spełniają następujące kryteria: FEV1 ≥ 30% wartości należnej, brak historii krwioplucia > 5 ml w ciągu 48 godzin przed wizytą, tolerują procedura indukcji plwociny. Warto zauważyć, że istnieje niewielka istotna różnica w jakości próbek do analizy między plwociną wypluwaną i indukowaną. Markery do testowania w sposób opisany powyżej.

• Kwestionariusz narażenia środowiska na grzyby. Zostanie wykonany przed zakończeniem wizyty w klinice. Ten kwestionariusz w całości jest zatwierdzonym kwestionariuszem używanym przez dr Andy'ego Liu. Biorąc pod uwagę ograniczenia czasowe dla uczestników badania, używamy zmodyfikowanego kwestionariusza skoncentrowanego na pytaniach zainteresowanych tym badaniem (np. związane z narażeniem na grzyby). Nie zostało to potwierdzone, ale może dostarczyć ważnych informacji w tym badaniu pilotażowym dla przyszłych badań

• Kolekcja serum. Pobranie krwi żylnej obwodowej zostanie przeprowadzone przez certyfikowaną osobę przy użyciu odpowiedniej sterylnej techniki przez CTRC. Próbki zostaną oznakowane zgodnie ze standardami protokołów badawczych. Markery do testowania opisano powyżej.

  • Wszystkie próbki plwociny należy przechowywać w banku i przechowywać do potencjalnej analizy mikrobiomu, mykobiomu i transkryptomu, oceniając ekspresję genów unikalną dla różnych szlaków zapalnych.

Szacunkowa wielkość próby: Moc i wielkość próby dla propozycji badania są ustalone ze względu na oczekiwaną liczbę kwalifikujących się pacjentów, którzy zostaną zrekrutowani do tego badania pilotażowego w oknie badania. Na podstawie wstępnych danych i opisanych definicji typów infekcji badacze przewidują, że w ciągu rocznej rekrutacji będą mogli zarejestrować około 10 osób bez infekcji grzybiczej, 10 pacjentów z infekcją grzybiczą, ale bez ABPA i 5 z ABPA . Podstawowy plan analizy koncentruje się na opisie i porównaniu kluczowych pomiarów osocza i plwociny opisanych w Tabeli 3. Analiza mocy zapewnia wykrywalne rozmiary efektów przy porównaniu grupy kontrolnej (bez zakażenia grzybiczego) z grupą bez ABPA lub z grupą ABPA. Obliczenia opierają się na mocy 80% i współczynniku błędu I rodzaju wynoszącym 0,05 dla dwustronnego dwupróbkowego testu t równej wariancji przeprowadzonego w oprogramowaniu statystycznym PASS wersja 15 (2). Próbki grup o wielkości 10 i 5 w grupach infekcji grzybiczych osiągają 80% mocy, aby odrzucić hipotezę zerową o zerowej wielkości efektu, gdy wielkość efektu populacji wynosi odpowiednio 1,36 i 1,66. Zatem moc badania wynosi 80%, aby wykryć różnicę w średnich mierzonych markerach większą niż 1,66 i 1,32 odchylenia standardowego. Biorąc pod uwagę ograniczone dane w literaturze dotyczące markerów Th2 w mukowiscydozie, opieramy te obliczenia na odchyleniach od średniej dla wielu testowanych przez nas markerów Th2.

Zbieranie i przechowywanie danych: Wszystkie osoby zostaną pozbawione elementów umożliwiających identyfikację po pobraniu próbek do badań i będą przechowywane z kluczem głównym. Dostęp do tych informacji będzie ograniczony przez PI i tylko niezbędny personel badawczy, który będzie mógł monitorować i przeglądać dane. Wszystkie dokumenty źródłowe w formie papierowej będą przechowywane w zamykanej szafce w magazynach zespołu badawczego CF. Dodatkowo, aby jeszcze bardziej zapewnić integralność danych, dane do tego badania będą przechowywane w systemie Research Electronic Data Capture (REDCap), który umożliwi ograniczony dostęp tylko do niezbędnych danych osobowych. REDCap umożliwia walidację w linii w celu zminimalizowania błędów transkrypcji i zapewnia powiadomienia w czasie rzeczywistym o przesłaniu danych oraz umożliwia natychmiastowe centralne monitorowanie i informacje zwrotne. Dostęp do danych wymaga szyfrowanego połączenia SSL (Secure Socket Layer), a zmiany są rejestrowane według identyfikatora użytkownika, znacznika czasu i projektu. Często tworzone są kopie zapasowe baz danych.