Perfis imunológicos na infecção fúngica da FC

Enquanto as bactérias são agentes predominantes na doença pulmonar da FC, os fungos são frequentemente isolados tanto no escarro quanto no líquido de lavagem broncoalveolar (BAL), mas seu papel na FC não é totalmente compreendido. A infecção fúngica na FC tem um amplo espectro de apresentações, variando de detecção transitória a infecção persistente, bronquite fúngica aguda com exacerbação pulmonar resultante, sensibilização a alérgenos fúngicos e aspergilose broncopulmonar alérgica (ABPA). Embora existam diretrizes clínicas para o diagnóstico e tratamento da ABPA em pacientes com FC, há poucas diretrizes e recomendações sobre monitoramento, cuidados clínicos e tratamento antifúngico nas várias apresentações da doença fúngica da FC; além disso, o impacto clínico dos fungos sem ABPA é pouco compreendido. Embora a inflamação na FC seja classicamente considerada um processo conduzido por neutrófilos e macrófagos (Th1), eosinófilos e citocinas alérgicas (Th2) mostraram-se elevados na presença de doença fúngica em estudos clínicos e em animais de FC. Estudos também mostraram diminuição da função pulmonar (p. por cento do volume expiratório forçado previsto em um segundo, ppFEV1) em indivíduos com detecção frequente de fungos no escarro e associações com infecção por Pseudomonas e uso de antimicrobianos. Adultos com FC também são mais propensos à sensibilização fúngica quando comparados a pacientes sem FC, além de apresentarem taxas mais altas de rinite alérgica e atopia. Em um estudo retrospectivo realizado em nosso centro, descobrimos que crianças com infecções fúngicas intermitentes ou crônicas apresentaram declínio mais rápido da função pulmonar em comparação com aquelas sem infecções fúngicas, independentemente do status da ABPA (ver dados preliminares). Entender se as infecções fúngicas são causadas por um processo inflamatório alérgico (Th2) pode alterar as abordagens de tratamento, utilizando esteróides e terapias antifúngicas mais prontamente em pacientes com infecção fúngica para combater o declínio da função pulmonar. Estudos limitados investigaram a frequência de sensibilização alérgica a patógenos fúngicos em indivíduos com FC, a frequência de sensibilização alérgica na população pediátrica de FC em geral e os perfis inflamatórios e fenótipos únicos de infecções fúngicas de FC, tanto no escarro quanto no soro.

Hipótese: Nossa hipótese é que crianças com FC e infecções fúngicas sem ABPA terão perfis inflamatórios alérgicos elevados e maior sensibilização a elementos fúngicos em comparação com aquelas sem infecção fúngica.

Objetivo Específico 1: Comparar a inflamação Th2 em pacientes com e sem infecções fúngicas em pacientes com FC e naqueles com ABPA.

• Abordagem: Obteremos amostras de soro e escarro de 25 pacientes com (1) infecção fúngica sem ABPA, n = 10 (definido como ≥ duas culturas fúngicas positivas nos últimos 18 meses), (2) sem infecção fúngica, n = 10, e (3) ABPA, n=5, e medir escarro específico e medições de citocinas séricas para avaliar as vias inflamatórias Th2 e Th1.
• Biomarcadores medidos: proteína catiônica eosinofílica (ECP), interleucina-4 (IL4), interleucina-5 (IL5), interleucina-10 (IL10), interleucina-13 (IL13) e contagem de eosinófilos no soro e no escarro.
• Resultado esperado: Indivíduos com infecção fúngica sem APBA terão marcadores Th2 elevados de inflamação em comparação com aqueles sem infecção fúngica. Também compararemos com aqueles com ABPA como um grupo de controle separado. Também mediremos marcadores Th1 para serem usados ​​como referência para perfis inflamatórios previamente estabelecidos vistos na FC, vendo se aqueles com doença fúngica se desviam para um processo mais direcionado para Th2.

Objetivo Específico 2: Investigar a sensibilização alérgica a elementos fúngicos em pacientes com FC com infecção fúngica sem ABPA em comparação com aqueles sem infecção fúngica e com ABPA.

• Abordagem: Iremos medir IgE total e soro ImmunoCAP testando níveis de IgE específicos para proteínas fúngicas de várias espécies (Aspergillus, Candida, etc). para determinar a sensibilização fúngica. Também entrevistaremos os pacientes em relação às exposições ambientais para explorar as relações com a sensibilização alérgica.
• Resultado esperado: Indivíduos com infecção fúngica sem ABPA terão maior probabilidade de apresentar sensibilização alérgica a elementos fúngicos quando comparados àqueles sem infecção fúngica.

Os resultados deste estudo ajudarão a caracterizar o perfil inflamatório associado às infecções fúngicas da FC, contribuindo para a compreensão da natureza infecciosa e alérgica da doença na população com FC. A partir disso, a contribuição para a fisiopatologia e as características clínicas das infecções fúngicas da FC servirá como um passo para a compreensão das opções de manejo, diretrizes de cuidados e progressão da doença para esse conjunto único de organismos difíceis de tratar.

Recrutamento: Propomos recrutar 25 pacientes com FC com idades entre 8 e 25 anos que concordam em participar deste estudo transversal que analisa as características do sistema imunológico de infecção fúngica e ABPA. Planejamos fazer a triagem de indivíduos que vêm à sua clínica de FC de rotina e abordá-los sobre seu interesse em participar deste estudo. A partir disso, explicaremos o conceito, as hipóteses e os procedimentos envolvidos com o intuito de agendá-los para uma visita de pesquisa.

Seleção de pacientes: Os pacientes serão recrutados no Centro de CF do CHCO por investigadores do estudo ou coordenadores de pesquisa qualificados no momento de uma visita clínica de rotina.

Visita de Estudo: Planejamos recrutar prospectivamente 25 indivíduos com FC durante um período de estabilidade clínica. Os participantes terão uma visita clínica de pesquisa que coincidirá com a visita clínica nas instalações da Clínica Pulmonar CHCO. As seguintes informações diagnósticas serão inseridas nos Formulários de Relato de Caso: informações demográficas, história diagnóstica e mutações, comorbidades relacionadas à FC, resultados históricos de microbiologia, incluindo resultados de cultura fúngica, medicamentos, incluindo terapia moduladora e regimes antibióticos de longo prazo, testes de alergia anteriores, critérios diagnósticos para ABPA (se aplicável). Também utilizaremos dados clínicos históricos do prontuário médico para estabelecer outras comorbidades, tendências e linha de base da função pulmonar, histórico de outras infecções bacterianas, histórico de diagnósticos de alergia e outros históricos médicos pertinentes e testes de diagnóstico (ou seja, resultados anteriores de tomografia computadorizada, exames de sangue anteriores, etc.). Serão realizadas as seguintes avaliações:

• Dados históricos no prontuário. Os exemplos incluem diagnósticos comórbidos relacionados à FC (como, entre outros, diabetes relacionada à FC, doença hepática da FC, asma, etc.), exames de sangue anteriores (como, entre outros, níveis séricos de IgE, testes de alergia anteriores, dados de broncoscopia e estudos de lavagem, exames de CF de rotina e de urgência/admissão, etc.), dados anteriores de espirometria e função pulmonar, dados nutricionais e de crescimento anteriores (IMC, níveis de vitaminas, etc.), dados anteriores de microbiologia e cultura, etc.
• Medições de IMC obtidas em visitas regulares à clínica de FC
• Altura e peso a serem obtidos e posteriormente calculados.
• Testes de função pulmonar obtidos em visitas regulares à clínica de FC. A espirometria será realizada de acordo com os critérios da American Thoracic Society, enquanto os valores absolutos serão convertidos em percentual previsto usando as equações de referência da iniciativa Global Lung Function34.
• Coleta de escarro. O escarro expectorado espontaneamente será usado tanto quanto possível. Ele será coletado em casa pelo paciente seguindo um regime de limpeza respiratória de rotina dentro de 12 horas após a consulta clínica. A amostra será colocada em um copo de espécime enviado pelo correio e colocada no gelo e levada para a consulta clínica. Se o escarro não puder ser expectorado antes da visita, tentaremos utilizar o escarro restante expectorado que não é usado para necessidades clínicas para análise e armazenamento adicionais. O escarro pode ser coletado por indução de escarro de acordo com o procedimento operacional padrão atual da CFF Therapeutics Development Network se 1) incapaz de expectorar, (2) o paciente atender aos critérios clínicos para indução de escarro e (3) a clínica for capaz de realizar pesquisa de escarro induzido com base no escarro atual Diretrizes COVID-19 para garantir a segurança do membro da equipe e o fornecimento adequado de EPI.

Por motivos de segurança, os procedimentos de indução serão realizados apenas para indivíduos que atendam aos seguintes critérios no dia da indução: VEF1 ≥ 30% do previsto, Sem histórico de hemoptise > 5 mL nas 48 horas anteriores à visita, Capaz de tolerar o procedimento de indução de escarro. É digno de nota que há pouca diferença significativa na qualidade da amostra para análise entre escarro expectorado e induzido. Marcadores a serem testados conforme descrito anteriormente.

• Questionário de exposição fúngica ambiental. Será realizado antes do término da visita clínica. Este questionário na íntegra é um questionário validado usado pelo Dr. Andy Liu. Dadas as restrições de tempo para os participantes do estudo, estamos usando um questionário modificado focado em questões de interesse para este estudo (por exemplo, relativos à exposição fúngica). Isso não foi validado, mas pode fornecer informações importantes neste estudo piloto para pesquisas futuras

• Coleta de soro. A coleta de sangue venoso periférico será realizada por indivíduo certificado usando técnica estéril apropriada pelo CTRC. As amostras serão rotuladas de acordo com os padrões do protocolo de pesquisa. Marcadores a serem testados descritos acima.

  • Todas as amostras de escarro devem ser armazenadas e salvas para análise potencial de microbioma, micobioma e transcriptoma, avaliando expressões gênicas exclusivas para várias vias inflamatórias.

Estimativas do tamanho da amostra: O poder e o tamanho da amostra para a proposta do estudo são fixos devido ao número esperado de pacientes elegíveis a serem recrutados para este estudo piloto durante a janela do estudo. Com base nos dados preliminares e nas definições descritas dos tipos de infecção, os investigadores antecipam que, em uma janela de recrutamento de 1 ano, poderão inscrever aproximadamente 10 indivíduos sem infecção fúngica, 10 pacientes com infecção fúngica, mas não ABPA e 5 com ABPA . O plano de análise primário se concentra na descrição e comparação das principais medidas de plasma e escarro descritas na Tabela 3. A análise de poder fornece os tamanhos de efeito detectáveis ​​ao comparar o braço de controle (sem infecção fúngica) com o grupo não ABPA ou o grupo ABPA. Os cálculos são baseados em um poder de 80% e taxa de erro Tipo I de 0,05 para o teste t bilateral de variância igual de duas amostras conduzido no software estatístico PASS versão 15 (2). Tamanhos de amostra de grupo de 10 e 5 nos grupos de infecção fúngica atingem 80% de poder para rejeitar a hipótese nula de tamanho de efeito zero quando o tamanho de efeito da população é 1,36 e 1,66, respectivamente. Assim, o estudo tem potência de 80% para detectar uma diferença nos marcadores médios a serem medidos maior que 1,66 e 1,32 desvios padrão. Dados os dados limitados na literatura sobre os marcadores Th2 na FC, baseamos esses cálculos nos desvios de uma média para os múltiplos marcadores Th2 que estamos testando.

Coleta e armazenamento de dados: Todos os indivíduos serão desidentificados após a coleta da amostra do estudo e armazenados com uma chave mestra. Haverá acesso limitado a esta informação com o PI e apenas pessoal de pesquisa essencial capaz de monitorar e visualizar os dados. Todos os documentos de origem impressos serão mantidos em um arquivo trancado nas instalações de armazenamento da equipe de pesquisa CF. Além disso, para garantir ainda mais a integridade dos dados, os dados deste estudo serão armazenados no sistema Research Electronic Data Capture (REDCap), que permitirá acesso limitado apenas a pessoas essenciais. REDCap permite validação em linha para minimizar erros de transcrição e fornece notificações em tempo real de envio de dados e permite monitoramento e feedback centrais imediatos. O acesso aos dados requer uma conexão Secure Socket Layer (SSL) criptografada e as alterações são registradas por ID de usuário, registro de data e hora e projeto. Os bancos de dados são copiados com frequência.