通过微生物群优化和调节来增强抗衰老能力 (ARMOR)

老年骨骼肌损失是影响老年人生活质量的非常严重的健康状况的关键点，例如丧失自主权、丧失健康认知以及发生复杂的代谢疾病。 此外，肠道微生物群可以通过粪便微生物群移植（FMT）进行调节，这种调节可能会对促进肌肉健康产生直接影响。 因此，该项目旨在调查使用年轻且训练有素的捐赠者通过 FMT 改变老年人的肠道微生物群是否可以增强骨骼肌的健康和功能，从而增强复原力，减少认知能力下降和与衰老相关的代谢功能障碍，特别是在压力环境下。

捐助者将是受过训练的年轻人。 为什么要训练捐赠者？ 越来越多的证据表明，肠道微生物群的组成受到体育锻炼的调节。 在动物研究中，长期运动已被证明可以增加肠道微生物群的生物多样性并减少全身和肠道炎症。 与运动相关的细菌谱是特定的，例如，它与与健康饮食相关的细菌谱并不对应，这表明体力活动允许肠道细菌群落中特定微生物谱的发展。 多项研究观察到，与运动相关的肠道微生物群的变化有利于促进个体肠粘膜完整性和整体代谢功能。

在人类中，与久坐的受试者相比，运动员的肠道细菌多样性更高（按体重、年龄和性别标准化）。 事实上，有证据表明，长期锻炼可以使肠道菌群失调的个体恢复健康状态。 在大鼠和小鼠中，长期运动会增加厚壁菌门、双歧杆菌和放线菌的生物多样性，并减少拟杆菌的比例。 一些数据显示肠道微生物群的存在如何影响肌肉性能，例如，发现无菌小鼠比无菌小鼠具有更强的游泳耐力，而当后者肠道内有细菌定植时，小鼠的游泳耐力增加他们的身体耐力和游泳时间更长。

该项目的主要目标是对身体活跃的年轻捐赠者进行粪便微生物群移植（FMT），以评估其对肌肉、认知和代谢功能的影响。 计划通过服用冻干微生物胶囊对老年人进行 FMT。 通过恢复微生物多样性，有望改善骨骼肌的质量和功能，从而提高认知和代谢弹性。 值得一提的是，肠道微生物群的改变与对大脑和代谢功能的直接和特定影响有关，因此该项目中提出的来自年轻且训练有素的捐赠者的 FMT 可能会产生影响。 该项目具有开发一种创新方法来治疗影响老年人的高度衰弱疾病的巨大潜力，该方法基于年轻和训练有素的捐赠者的肠道微生物群的冻干和封装，这些微生物群可以很容易地保存在传统的冰箱中。 这种方法之前已用于治疗艰难梭菌感染，并取得了显着的效果。 这一想法将对成人和老年患者的生活质量产生深远的影响，因为它可以作为老年人必须接受的预防或治疗肌肉减少症的体育锻炼疗法的替代或补充选择，但由于以下原因往往无法充分实现与年老相关的身体限制。 由于全世界老年人的比例很高，而且老年人中肌肉减少症的患病率很高，研究人员的目标是解决一个重大的公共卫生问题，大量目标人群渴望促进肌肉健康、功能自主以及认知和认知的选择。新陈代谢健康。

研究问题。 该假设如下：来自受过训练的年轻捐赠者的肠道微生物群移植可通过增强肌肉功能来提高恢复能力，从而保持暴露于压力环境的老年人的认知和代谢性能。

一般目标和具体目标。 一般目标 证明来自年轻且经过身体训练的捐赠者的粪便微生物群移植可促进肌肉性能，防止老年人在压力环境下认知和代谢下降。

具体目标 评估受过训练的年轻捐赠者的粪便微生物群移植 (FMT) 对老年人肌肉健康的影响，并将结果与​​老年 FMT 接受者的压力暴露程度相关联。

旨在评估经过培训的年轻捐赠者的粪便微生物群移植 (FMT) 对老年接受者认知参数的影响，并将结果与​​个体压力水平和 FMT 后肌肉功能的改变相关联。

评估训练有素的年轻捐赠者的粪便微生物群移植 (FMT) 对老年接受者代谢参数的影响，并将结果与​​个体压力水平和 FMT 后肌肉功能的改变相关联。

在这些目标中，研究人员旨在调查训练有素的年轻捐赠者的 FMT 是否可以改善老年人的肌肉功能，对认知和代谢功能产生有益的影响，并将结果与​​参与者的压力暴露程度相关联。

实验设计。 该研究是一项随机、安慰剂对照、双盲临床试验。 研究人员将与 92 名老年人（年龄 65-84 岁，女性和男性）一起进行研究。 实验设计中提到的所有特征，以及通过实施研究人员旨在回答以下问题的事实：治疗（在本例中为 FMT）是否产生益处（在本项目中，是肌肉、认知或代谢益处） ）在某种状况或疾病（衰老和压力环境）的情况下？ 同时为了评估干预措施的安全性，将该研究归类为 II 期临床研究。 签署知情同意文件后，参与者将在洛斯安第斯大学诊所或智利大学营养与食品技术研究所 (INTA) 招募。 FMT 将使用洛斯安第斯大学生物医学研究与创新中心 (CIIB) 制造的冻干粪便微生物群胶囊进行注射。

粪便微生物群捐赠者。 捐赠者将是年轻的个体（年龄20至35岁，2男2女），身体活跃，每周至少进行150分钟的高强度有氧身体活动，因为这种类型的训练可以提高多样性和生产力人类肠道微生物群的短链脂肪酸（SCFA）。 全球体力活动问卷 (GPAQ) 和体动记录仪将用于在粪便捐赠前 2 周测量捐赠者的体力活动。 对于捐赠者的选择，个人将被视为已达到每周 600 分钟或更多的代谢当量 (MET)。

捐赠者将满足捐赠粪便微生物群的所有标准（已为 CDAD 患者的 FMT 治疗制定的标准。

在选择过程的初始阶段，将使用专门的调查问卷评估潜在捐赠者的病史和风险行为。 调查问卷将由医疗专业人员进行。 客观评估包括对选择过程的具体反应的后果。 本调查问卷要解决的主题和要素列于表 1。

表 1. 在批准粪便微生物群移植 (FMT) 之前选择捐赠者期间需要评估的要素

传染病

• 慢性活动性传染病史或接触史：艾滋病毒、乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV)、未成功根除的幽门螺杆菌、梅毒、疟疾、锥虫病、结核病、恰加斯病、类圆线虫病。
• 过去 6 个月内任何当前活跃或相关的感染。
• 过去 8 周内接种过减毒活病毒疫苗。 出生国家。 危险行为
• 当前或以前使用静脉注射药物。
• 过去 6 个月内有高风险性行为。
• 过去 6 个月内前往高风险国家/地区旅行。
• 目前所处环境有利于获取潜在病原体（例如兽医、动物看护人、护林员、监狱工作人员）。
• 过去 6 个月内进行过纹身、穿孔或针灸。
• 过去 6 个月内接受过大型手术。
• 过去 6 个月内接触过人体血液（例如事故、针刺伤）。
• 监禁历史。
• 先前的组织/器官移植。
• 病史最近 6 个月内输注过血液制品（例如浓缩红细胞、血浆、血小板、免疫球蛋白）。

病史

• 慢性疾病。
• 克雅氏病（风险）。
• 过敏或特应性（例如食物或药物过敏、哮喘）。
• 过去 4 个月内住院过。
• 持续怀孕。
• 过去 3 个月内计划或接受的抗生素治疗。
• 定期服用药物或营养补充剂。
• BMI（如果≥20且≤25 kg/m2则接受）。
• 年龄（≥18 岁且≤30 岁则接受）。

肠道健康

• 既往或计划进行胃肠道手术，阑尾切除术除外。
• 近3个月内出现胃肠道症状（如腹泻、便秘、便血、呕吐、腹痛），或腺瘤性息肉或无蒂锯齿状病变（切除）。
• 过去 3 个月内任何其他相关的临床体征或症状（例如发烧或皮疹）。

除了表 2 中描述的所有传染源外，还可以通过粪便中的 RT-PCR 排除 SARS-CoV-2。 将通过经典培养和 PCR 分型来研究大肠杆菌 ST131 的存在以及抗生素抗性基因的存在。 如果这些标记物获得阳性结果，则该个体不能成为捐赠者。 每剂 FMT 至少使用 150 克粪便，并在尽可能厌氧的条件下运送到实验室（GutAlive 系统 https://www.microviable.com/en/gutalive-2/） 并在尽可能短的时间内收集。 粪便是一种复杂的样品，因为其含水量可变，标准化剂量的唯一方法是通过粪便的重量，因为最终粉末的量可能变化很大。 因此，所得胶囊的数量可能差异很大。 然而，只要保持相同的对数顺序，微生物负荷就会相等。 将粪便与半脱脂无乳糖牛奶按 1:2 的比例混合作为冷冻保护剂，进行冻干。 将混合物在 Stomacher (230 rpm) 中均质化，通过温和离心（500 rpm 5 分钟）去除固体残留物，然后通过离心（10,000 rpm 15 分钟）收集所有微生物。 除去上清液，将沉淀在-80℃冷冻至少1小时，然后在-50℃冻干18-20小时。 将获得的粉末分批装入肠溶胶囊中，在4°C、防潮的情况下储存，保质期为6个月。 所有过程的等分试样将储存在 -80°C 下，样品和供体的可追溯性将使用 RedCap 软件进行。

老年人参与者 参与者人数：92 种族：智利人口。 智利人口种族单一，有土著血统（40%）和欧洲血统（60%）。

年龄：65-84岁 生理性别：男性46人，女性46人

研究的招募、随机化、干预和随访过程按以下步骤组织：

• 招募：招募参与者并进行资格评估。 对他们进行评估以确定他们是否符合纳入标准以及不符合排除标准。
• 知情同意：符合研究标准的合格参与者提供参与的知情同意书。
• 干预前评估：在干预之前，对参与者进行评估，根据他们的压力和焦虑水平对其进行分类。
• 随机化：总共 92 名参与者被随机分为四组：

低压力水平 - 安慰剂组 (n=23) 低压力水平 - IMT 组 (n=23) 中/高压力水平 - 安慰剂组 (n=23) 中/高压力水平 - IMT 组 (n=23)

干预：四组的参与者接受指定的干预：

第一组接受低压力水平分类的安慰剂。 第二组接受低压力级别分类的 IMT（兴趣干预）。

第三组接受中/高压力水平分类的安慰剂。

第四组接受中/高压力级别分类的 IMT。

随访：在干预后第 1、4、8 和 20 周对所有组进行随访评估，以评估干预结果。

这项研究是一项随机、安慰剂对照、双盲临床试验。 这种结构使研究能够比较干预措施 (IMT) 与安慰剂在不同压力水平分类下的效果。

干预前评估：

14 项感知压力量表 (PSS-14) 将用于评估参与者的压力水平。 抑郁症状将使用 15 项老年抑郁量表 (GDS) 进行评估，该量表评估通常与老年人经历的抑郁症相关的情绪障碍症状（附上两份文件）。 焦虑症状将使用贝克焦虑量表（BAI）进行测量，该量表旨在获得相对独立于抑郁的焦虑测量（见附件）。 这些工具在社区样本中具有很高的信度和效度，使我们能够将志愿者分为低压力焦虑组和中/高压力焦虑组。

为了有利于新生态系统的建立，在FMT之前将使用利福昔明（一种适合肠道净化的不可吸收抗生素）降低参与者的肠道微生物密度，持续3天，1,200毫克/天，每天服用2剂。 将向参与者提供抗生素及其给药时间表。

FMT 将在洛斯安第斯大学诊所的临床试验室进行，服用 4 粒由约 150 克粪便制成的胶囊（含有紧凑的冻干制剂）。 对照受试者将接受外观与含有肠道微生物冻干材料的胶囊相同的安慰剂胶囊。 将为参与者提供住家和洛斯安第斯大学诊所之间的免费交通。

研究人员将仅使用非侵入性测试和分析来进行这项研究。 所有建议的测量肌肉、认知和代谢功能的评估都将在 FMT 之前和之后（FMT 后 1 至 20 周）进行。 这些评估将在国家农业技术研究所 (CEDINTA) 的流动护理健康中心进行。 将为参与者提供住所和 CEDINTA 之间的免费交通。 所有参与者在干预前后都将接受病史调查，以获取有关整体健康状况、药物使用、抗生素和膳食补充剂、肠道疾病史以及可能改变肠道微生物群的任何其他肠道疾病的信息。

研究人员将计算 FMT 前后所有组参与者的衰弱指数 (FI)。 FI 将使用临床和实验室参数的组合方法进行评估。 首先，研究人员将使用由 30 个变量创建的自我报告 FI 来评估健康状况。 变量包括不同类型的健康问题，包括疾病（n=9）、症状（n=6）、生活障碍（n=6）、心理问题（n=2）、Romberg测试、身体表现、老年抑郁量表（ GDS）分数和简易精神状态检查（MMSE）分数。 对于二元变量，损伤的存在将被编码为“1”；以及它的缺失为“0”。 对于每个三水平变量，将使用 0.5 来表示中间响应水平。 对于MMSE，如果>23，则编码为0；如果MMSE=15-23，则编码为0.5；如果MMSE≤14，则编码为1；而GDS，如果GDS<11，则编码为0，如果GDS≥11，则编码为1。 其次，基于实验室的 FI（FI-lab）将根据 9 项实验室测试确定 15 个参数，此外还有脉搏、收缩压和舒张压、脉压、BMI 和腰围。 正常参考范围将用于比较每个参数，其中“0”表示正常范围内的值，“1”表示参考范围之外的值。 最后，研究人员将这两个 FI 结合起来构建一个 45 项 FI（FI-combined）。 每个 FI 组合将被定义为个体每个参数的得分除以所考虑的参数总数，FI 的范围从理论最小值 0（不存在受损参数）到最大可能 1.0（所有受损参数）存在参数）。

为了评估肌肉减少症，研究人员将使用双能 X 射线吸收测定法 (DEXA) 和肌酐排泄来测量瘦肉量和脂肪量。 标准测力计将用于测量等长力量。 此外，还将应用短期体能测试和 6 分钟步行测试来估计最大耗氧量。 将使用体动记录仪评估 7 天的体力活动。 研究人员将使用超声波测量参与者大腿的股直肌厚度和肌肉羽状角度。 作为肌肉减少症的生物标志物，肌酸激酶 (CK)、骨骼肌肌钙蛋白 T (sTnT)、胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)、C 反应蛋白、维生素 D、TNF-α、IL-6、IL- 1β 将在血液中测量。

对于认知表现，将在 FMT 干预之前和之后对参与者的一系列较高认知能力进行评估，例如注意力、执行功能、工作记忆、语言和处理速度等。 将进行蒙特利尔认知评估 (MoCA)、轨迹测试 A 和 B、向前和向后数字跨度、正面评估电池 (FAB) 和言语流利度 (FAS)（附件）。 参与者的生活质量将使用 SF-36 问卷进行评估，该问卷是健康相关生活质量 (HRQoL) 最常用和评估的工具之一。

对于代谢功能，将在禁食条件下对血液中的代谢标志物如胰岛素、葡萄糖、总胆固醇、LDL-胆固醇、HDL-胆固醇、甘油三酯和转氨酶（ALT、AST、gGT）进行全面分析。 研究人员将使用超声成像研究非酒精性脂肪肝（NAFLD）的存在。 此外，血清中金属蛋白酶 9 和 IL-6 的浓度将通过 ELISA 进行测量，因为这些标记物已被认为与人类 NAFLD 的严重程度相关。 还将应用肝纤维化的非侵入性评分。

利用从参与者粪便样本中分离出的细菌基因组 DNA，研究人员将使用鸟枪法宏基因组学或 16S 基因测序来研究微生物群概况。 在 FMT 之前和之后都会从年轻的捐赠者和老年接受者身上收集样本。 使用生物信息学工具，研究人员将识别接受过训练有素的年轻捐赠者的 FMT 的老年人的细菌特征。 研究人员将确定这种微生物特征是否与肌肉、认知和代谢弹性相关，特别是在承受较高压力的群体中。 研究人员提出，这种改变的老年人肠道微生物群的关键元素将作为衰老背景下肌肉、认知和代谢弹性的适当生物标志物。

安全性 由合格人员进行的 IMT 尚未与任何严重不良事件相关，但可能会发生轻微或常见不良反应。 马塞拉等人。 (2021) 在一项系统评价中分析了 IMT 不良反应的存在，评估了涉及 4,241 名患者的 129 项研究。 他们发现，IMT 后 24 小时内最常见的不良反应是短暂性腹泻 (10%)、短暂性腹部痉挛/不适 (7%)、恶心和呕吐 (<5%)。 不到 2% 的病例还报告有短暂发热、腹胀、疲劳和腹鸣。 随访期间报告有便秘（2%）和过度胀气（3%）。

严重不良反应，例如 IMT 直接导致的菌血症和死亡，极为罕见（发生率 <0.1%），并且仅发生在患有导致消化粘膜损伤的疾病的患者中。 这些疾病（炎症性肠病、克罗恩病、艰难梭菌感染 (CDI) 和溃疡性结肠炎）是本研究的排除标准。 2022 年的另一项研究评估了 5,344 名 CDI 患者使用 IMT 的安全性。 研究人员发现，总体而言，对于通常临床结果较差的医学复杂的患者群体来说，安全性是有利的。 在队列中，194 名患者 (3.6%) 经历了一种或多种严重不良反应 (SAR)。 SAR 在严重或严重并发症 CDI 患者中更为常见 (n = 94 [48.5%])。 在 SAR 中，有 6 个事件 (0.1%) 可能与 IMT 有关，所有事件均发生在严重免疫功能低下的患者中。 其中包括两名发烧患者，以及一名患有严重并发症 CDI 和乳腺癌的腹痛患者。 此外，两名患者出现全身炎症反应综合征——一名在心脏移植后，一名在肾移植后。 据报道，一名有溃疡性结肠炎病史且无法通过生物疗法和免疫调节剂控制的患者出现炎症性肠病 (IBD) 发作。 报告的 SAR 均未与 IMT 明确相关。 值得注意的是，没有报告败血症或与 IMT 相关的传染病传播病例，包括多重耐药微生物感染。 这项研究不包括 CDI 患者或严重免疫功能低下的患者。

最后，2022 年的另一项系统回顾和荟萃分析搜索了 CDI 患者的 IMT 研究，使用与 IMT 相关的 SAR 发生率作为主要结局。 次要结局包括与 IMT 无关的 SAR 和与 IMT 相关的轻微不良事件。 对接受 5,551 次 IMT 的 5,099 名患者的综合分析显示，与 IMT 相关的 SAR 在不到 1% 的患者中发生。 与IMT无关的SARs综合发生率较高，达到2.9%。 轻微不良事件的综合发生率也显示出罕见的自限性胃肠道和全身不适。 该荟萃分析支持 IMT 作为治疗复发性 CDI 的安全选择。

对于仅在老年人群中进行的 IMT，一项针对 31 名平均年龄为 77 岁的 CDI 患者的研究报告称，87% 的患者解决了感染，31 名受访者中有 4 名（13%）报告的最常见不良事件是关节炎的主观恶化。 另一项对 35 名患有 CDI 的老年患者（平均年龄 77 岁）进行 IMT 的研究报告称，没有出现严重的不良反应。

综上所述，文献报道的国际IMT使用经验表明该手术具有较高的安全性。 但应考虑以下风险： (1)感染：虽然IMT已筛查病原菌、病毒、真菌和寄生虫，但仍存在传播供体粪便中已知和未知感染性微生物的风险。 理论上也存在小肠细菌过度生长的风险。 IMT 后极少数情况下会发生菌血症（例如大肠杆菌、克雷伯氏菌）、败血症和致命事件； (2) 患有潜在 IBD 的个体炎症性肠病 (IBD) 恶化； (3) 对供者粪便中存在的抗原过敏/过敏反应； (4)非传染性疾病的传播：理论上存在发生可能与供体肠道菌群有关的疾病的风险。 这些包括肥胖、代谢综合征、心血管疾病、自身免疫性疾病、过敏/特应性疾病、神经系统疾病、精神疾病和恶性肿瘤。 在该研究中，这种风险非常有限，因为根据本方案中解释的捐赠者筛选程序，患有这些已知疾病的个体被排除在粪便捐赠之外。