Přesná diagnostika zánětlivých onemocnění střev, buněčná terapie a transplantace (The PREDICT Trial) (PREDICT)

hypotézy:

Hypotéza č. 1: Vyšetřovatelé předpokládají, že mohou definovat molekulární mechanismy odpovědné za zánětlivé onemocnění střev (IBD) a gastrointestinální (GI) akutní GVHD a odlišit je od jiných zánětlivých onemocnění pomocí pokročilé imunologické analýzy včetně průtokové cytometrie, hlubokého sekvenování TCR a transkriptomiky. .

Hypotéza č. 2: Vyšetřovatelé dále předpokládají, že longitudinální systémová imunologická analýza umožní pacientovi specifické určení molekulární evoluce IBD, stejně jako akutní a chronické GVHD, jakož i posttransplantačních defektů ochranné imunity, a určí, které cesty, když je narušen, může způsobit klinické onemocnění. Objev těchto cest povede ke zlepšení diagnostických, prognostických a léčebných přístupů a k personalizovanému terapeutickému rozhodování u pacientů podstupujících transplantaci hematopoetických kmenových buněk (HCT).

Hypotéza č. 3: Předpokládáme, že můžeme definovat molekulární mechanismy, fenotypové a funkční imunologické charakteristiky zapojené do různých determinant adoptivních buněčných terapií, včetně účinnosti, dlouhověkosti a toxicity spojené s buněčnou terapií. Podélná charakterizace buněčných terapeutik a endogenní imunitní reakce, kterou vyvolávají, pomocí pokročilé imunologické analýzy včetně průtokové cytometrie, hmotnostní spektrometrie, TCR hlubokého sekvenování a jednobuněčné transkriptomiky umožní identifikaci a rozlišení drah kritických pro účinnost a toxicitu a umožní následnou terapeutickou modulaci.

Hypotéza č. 4: Předpokládáme, že rozdíly ve střevním mikrobiomu pacientů s IBD a příjemců HCT hrají hlavní roli v závažnosti onemocnění a celkových klinických výsledcích u obou onemocnění (např. bakteriémie, nevysvětlitelné horečky, úmrtnost). Podélná charakterizace střevních mikrobiálních komunit pomocí sekvenování nové generace umožní detekci sekvenčních mikrobiálních změn, které se shodují s pozorovanými klinickými změnami. objev významných změn v mikrobiomu, které jsou opakovaně pozorovány s konkrétním klinickým výsledkem, povede k lepšímu mechanickému pochopení jeho patofyziologie a poskytne informace pro budoucí diagnostické a preventivní přístupy.

Hypotéza č. 5: Předpokládáme, že imunitní dysregulace spojená s širokým spektrem poruch změní imunitní odpověď na vakcíny, čímž se u těchto populací zvýší náchylnost k infekčním chorobám. Konkrétně příjemci HCT a transplantovaných solidních orgánů, stejně jako pacienti s aktivní nebo nedávnou anamnézou zhoubného bujení nebo autoimunitních onemocnění mohou mít snížené reakce T a B buněk na očkování proti SARS-CoV-2 v důsledku účinku patofyziologie onemocnění nebo léčebných režimů na imunitní funkce. Komplexní sérologická analýza, průtoková cytometrie s vysokými parametry a sekvenování RNA T a B buněk umožní longitudinální analýzu titrů neutralizačních protilátek a expanze, fenotypu, diverzity a přežití T ​​a B buněk specifických pro antigen u těchto populací pacientů, jakož i v souvisejících a nesouvisejících zdravých kontrolách. Tato data poskytnou mechanický pohled na to, jak poškození imunity u těchto poruch přispívá ke špatným reakcím na infekce. Vzhledem k tomu, že SARS-CoV-2 je patogen, ke kterému velká část populace zůstává naivní, představuje to jedinečnou příležitost studovat imunitní odpověď na novou výzvu u imunokompromitovaných jedinců. Kromě toho budou tato zjištění informovat o pokynech pro veřejné zdraví, jak zlepšit opatření na ochranu zranitelného obyvatelstva před nemocemi, kterým lze předejít.

Cíle:

Specifický cíl č. 1: Identifikovat mechanismy specifické pro IBD a GI akutní GVHD a odlišit je od jiných zánětlivých poruch.

Cíl 1: Provést průtokovou cytometrii, hluboké sekvenování TCR a analýzu celého transkriptomu na T buňkách purifikovaných ze vzorků GI tkáně odebraných pacientům, kteří podstoupili endoskopii pro předpokládanou GI GVHD, zánětlivé onemocnění střev (IBD) a funkční gastrointestinální onemocnění (FGID).

Cíl 2: Provést průtokovou cytometrii, hluboké sekvenování TCR a analýzu transkriptomu na T buňkách z periferní krve v době endoskopie u pacientů s diagnostikovanou GI GVHD, IBD a FGID.

Specifický cíl č. 2: Charakterizovat imunologickou dysregulaci odpovědnou za IBD, akutní GVHD, chronickou GVHD a defekty ochranné imunity u pacientů podstupujících HCT.

Cíl 1: Provést longitudinální imunitní analýzu na T buňkách a B buňkách purifikovaných od pacientů s IBD a pacientů podstupujících alogenní HCT. U pacientů po transplantaci porovnáme imunitu T a B buněk u pacientů, u kterých se po transplantaci rozvine akutní a chronická GVHD, relaps a infekční komplikace, a porovnáme s pacienty bez těchto komplikací.

Cíl 2: Provést analýzu mikrobiomu longitudinálně u pacientů s IBD a pacientů podstupujících HCT za účelem zjištění vlivu změn mikrobiomu na rozvoj potransplantačních komplikací.

Specifický cíl č. 3: Identifikovat molekulární a buněčné imunologické mechanismy podílející se na určování klinické odpovědi na buněčné terapie a odlišit dráhy kritické pro úspěšnou protinádorovou odpověď od těch, které se podílejí na nežádoucích účincích.

Cíl 1: Charakterizovat buněčný produkt před podáním a sledovat jeho distribuci, kinetiku, perzistenci a funkci longitudinálně in vivo v periferní krvi pacienta a případně v kostní dřeni, mozkomíšním moku a dalších tkáních pomocí detekce transgenů na bázi qPCR (pokud je to vhodné), průtoková cytometrie, hmotnostní cytometrie, hluboké sekvenování TCR a analýza celého transkriptomu na T buňkách a dalších imunitních buňkách obsažených v buněčném produktu.

Cíl 2: Podélně zkoumat souhru buněčné terapie s endogenním imunitním systémem a vymezit roli endogenní imunitní odpovědi v účinnosti, perzistenci a toxicitě buněčné terapie pomocí průtokové cytometrie, masové cytometrie, TCR hlubokého sekvenování, analýzy celého transkriptomu na endogenních imunitních buňkách a analýze rozpustných faktorů a protilátek.

Specifický cíl č. 4: Charakterizujte antigenně specifickou adaptivní imunitní odpověď na očkování proti SARS-CoV-2 u pacientů s imunitní dysregulací v důsledku rakoviny, transplantace nebo autoimunitního onemocnění a identifikujte mechanismy, které jsou základem narušeného vytváření trvalé imunity.

Cíl 1: Provést komplexní longitudinální analýzu sérologické imunity před a po vakcinaci, včetně posilovacích vakcín, u pacientů a zdravých kontrol, včetně posouzení hladin specifických protilátek SARS-CoV-2 a titrů neutralizačních protilátek.

Cíl 2: Použití vysokoparametrové průtokové cytometrie, jednobuněčného sekvenování RNA (scRNAseq) a analýzy repertoáru T a B buněk k charakterizaci dlouhodobého vývoje antigenně specifické paměti T a B buněk k SARS-CoV-2 po vakcinaci a následných posilovacích vakcínách u pacientů a zdravých kontrol.

Cíl 3: Zhodnotit schopnost sér a klonovaných protilátek od pacientů reagovat na vazbu a neutralizovat virové varianty ve srovnání se zdravými kontrolami.

Pozadí a význam:

IBD: Zánětlivé onemocnění střev (IBD), které zahrnuje Crohnovu chorobu (CD) a ulcerózní kolitidu (UC), je chronické komplexní gastrointestinální (GI) autoimunitní onemocnění, které postihuje 1,4 milionu lidí ve Spojených státech1. Incidence a prevalence CD i UC se postupem času zvyšuje a zahrnuje větší oblasti světa1,2. Kromě toho dětské IBD tvoří 25 % všech diagnostikovaných IBD, což vede dítě k celoživotnímu gastrointestinálnímu onemocnění a vystavení imunosupresi, zejména během období určeného pro růst a vývoj. Navzdory probíhajícímu výzkumu patogeneze a genetických abnormalit není mechanismus rozvoje a progrese IBD dobře pochopen. Standardní terapie stále spoléhají na steroidy, další nespecifickou imunosupresi (jako je methotrexát a azathioprin) a anti-TNF biologika. Ačkoli se objevují novější terapie, jako jsou činidla, která blokují cytokiny a transport leukocytů, nebyly identifikovány žádné univerzálně úspěšné léčby. Recidivující formy IBD tedy nadále vedou k systémovému ohrožení nutriční absorpční kapacity, anémii a často k nutnosti chirurgických zákroků. Rozluštění mechanismů pohánějících jedinečné podtypy IBD (dokonce i v rámci UC a CD) a poté optimalizace léčby na základě základní systémové dysregulace je kritickou neuspokojenou potřebou v této oblasti. Zatímco základní imunitní mechanismus IBD zůstává neznámý, existují významné údaje, které naznačují, že IBD může představovat nepřiměřenou imunitní odpověď vůči vlastním antigenům a komenzální mikrobiotě u geneticky vnímavého hostitele3. Modely myší kolitidy tedy naznačují, že zánět sliznice je výsledkem patologických reakcí pomocných T-buněk (Th) spolu s defekty regulačních buněk. Tato data vyplynula z experimentů u myší s deficitem IL-24, myší s deficitem IL-105, TGF-beta6 a TGF-betaGRII dominantně negativních transgenních myší7. Patogeneze také zahrnuje zveličení reakcí efektorových buněk, které vyplynuly z experimentů na transgenních myších Stat48 a myších mutantu TNFARE9. Novější analýza lidských cytokinů naznačuje, že navzdory klinickým podobnostem vykazuje každý podtyp IBD výrazné cytokinové profily10. Přestože se počáteční studie začaly zaměřovat na specifické dráhy efektorových T lymfocytů11, aplikace transkriptomiky cílových orgánů je v plenkách a jednotlivé cílené dráhy jsou stále v nedohlednu.

HCT: Alogenní HCT je účinná léčba pro pacienty s maligními i nezhoubnými hematologickými onemocněními. Tato léčba je však komplikovaná vysokou morbiditou a mortalitou, což omezuje její širší použití. Mezi hlavní příčiny potransplantační morbidity a mortality patří akutní a chronická GVHD, relaps a infekční onemocnění. Cílem studie PREDICT je aplikovat systémový přístup k pochopení mechanismů, které řídí tyto komplikace, tak, aby bylo možné navrhnout léčebné strategie založené na důkazech.

Akutní GVHD: Akutní GVHD je zprostředkována aktivací allo-reaktivních T-buněk pocházejících od dárce a výsledkem je cytotoxicita proti hostitelským buňkám12,13 a také poškození tkáně zprostředkované cytokiny. Středně závažná až závažná akutní GVHD se může vyskytnout až u 60 % pacientů podstupujících HCT a závažnější formy byly spojeny s úmrtností >50 %14-17. Nejčastějšími místy imunitně zprostředkovaného poškození tkáně jsou játra, kůže a gastrointestinální (GI) trakt. GI GVHD se vyskytuje u 40–50 % pacientů s HCT a je hlavní příčinou morbidity a mortality na toto onemocnění17.

Diagnóza GI GVHD je odvozena z klinických a histopatologických nálezů. GVHD se může objevit v horním i dolním GI traktu, což vede k příznakům průjmu, bolesti břicha, nevolnosti, zvracení a/nebo anorexii12. Histopatologická diagnostická kritéria pro GI GVHD zahrnují identifikaci apoptózy buněk krypt, destrukce krypt a/nebo denudace sliznice18. Bohužel závažnost GVHD v histologii špatně koreluje s klinickým průběhem onemocnění.

Zatímco GI GVHD je běžnou komplikací po HCT, zůstává mnoho překážek bránících její konzistentní a přesné diagnóze. Za prvé, diagnóza závisí na vhodném odběru vzorků tkáně. Viditelné léze často chybí19 a endoskopické nálezy mohou být difuzní a nespecifické. Neexistuje také konsenzus ohledně optimálního umístění GI traktu pro biopsie nebo počtu biopsií potřebných k zajištění diagnózy. Častá je také neshoda mezi bioptickými vzorky z horního a dolního GI traktu20. Zadruhé, pacienti, kteří se dostaví časně v průběhu GVHD, mohou mít jemné histopatologické nálezy, které mohou být přehlédnuty nebo ještě nejsou přítomny. Na počátku GVHD může být pozorováno několik apoptotických buněk a může ještě dojít ke ztrátě krypt a poškození sliznice18. A konečně existují také matoucí faktory, které mohou vést k nesprávné diagnóze GVHD, mezi něž patří toxicita související s přípravným režimem, doprovodné infekce a léky, které všechny mohou způsobit fokální zánět GI traktu. V prvních 20 dnech po myeloablativním přípravném režimu lze pozorovat difúzní apoptózu napodobující akutní GVHD21. Infekce Clostridium difficile a cytomegalovirové infekce mohou mít také podobné klinické a histopatologické projevy22. Bylo také zjištěno, že použití mykofenolát mofetilu23 a inhibitorů protonové pumpy24 souvisí s apoptózou GI traktu, která může být chybně diagnostikována jako GVHD. Všechny tyto faktory vedou k vysokému stupni variability mezi pozorovateli v histologické diagnóze GVHD18,25 a špatné korelaci s klinickými pozorováními, což ilustruje potřebu citlivějších a specifičtějších metod diagnostiky.

V poslední době došlo k pokroku v identifikaci biomarkerů u GVHD, které mají diagnostický a prognostický význam. IL-8, IL-2 receptor-alfa, tumor nekrotizující faktor receptor-1 (TNF-1), hepatocytový růstový faktor (HGF), elafin, regenerující 3-alfa (reg-3alfa), TIM3, IL-6 Bylo zjištěno, že ST2, B-buněčný aktivační faktor (BAFF), IL-33, CXCL10 a CXCL11 jsou užitečné při předpovídání vývoje GVHD26-28. I když byly tyto biomarkery identifikovány, nebyly rozsáhle validovány a musí být ještě klinicky přijaty jako vodítko pro změnu léčby. Dosud objevené biomarkery jsou navíc často výsledkem poruch downstreamových drah a odhalení upstream dysregulace, ke které dochází dříve v průběhu onemocnění, může být cenné při vývoji diagnostických nebo prognostických modelů, které by mohly vést k pokusům zaměřeným na změnu přirozeného průběhu onemocnění. nemoc.

Naše skupina již dříve ukázala, že pomocí pokročilé imunologické analýzy včetně průtokové cytometrie a analýzy celého transkriptomu můžeme identifikovat dříve nerozpoznané molekulární dráhy aktivní v GVHD29-31. Předpokládáme, že využitím přístupu systémové imunologie u pacientů s akutní GVHD budeme schopni identifikovat cesty, které mají diagnostickou a prognostickou hodnotu. To může zvýšit naši diagnostickou kapacitu a co je nejdůležitější, umožnit nám individualizovat léčbu pacientů na základě jejich specifických imunologických profilů.

Chronická GVHD: CGVHD se vyskytuje u 40–60 % pacientů po transplantaci32–35, přičemž incidence tohoto onemocnění v posledních 2 dekádách stoupá36, chronická GVHD způsobuje významnou úmrtnost a u těch pacientů, kteří přežijí, může mít zásadní vliv na kvalitu života37 -40. Přes zvýšenou frekvenci chronické GVHD stále chybí přesná diagnóza a terapie založená na důkazech. Zatímco tedy byly identifikovány chronické biomarkery GVHD, dosud nebyly nalezeny žádné, které by se kvalifikovaly pro klinické použití41. Kromě toho tyto biomarkery často představují poruchy v konečné fázi a mohou být výsledkem nespecifického zánětu a poškození tkáně, stejně jako kontraregulačních mechanismů. Kromě problémů v diagnostice existují také významné problémy s léčbou: Léčba chronické GVHD se tedy v posledních několika desetiletích významně nezměnila. Léčba první linie zůstává kortikosteroidy s nebo bez inhibitorů kalcineurinu (CNI)42-44 a bohužel přibližně 50 % pacientů selže a vyžaduje léčbu druhé linie45,46 s přežitím bez selhání po 2 letech po terapii druhé linie je pouze 25 % 47. Tyto údaje podtrhují významné neuspokojené potřeby v této oblasti, a to jak pro molekulární diagnostiku, tak pro paradigmata léčby založená na důkazech.

Ochranná imunita: Kromě výzev akutní a chronické GVHD čelí pacienti podstupující HCT a pacienti s IBD také dalším toxicitám, z nichž mnohé souvisí s dysfunkční imunitní rekonstitucí po transplantaci. Ačkoli je však fenomenologie mnoha defektů ochranné imunity (jak proti infekčním patogenům, tak proti relapsu leukémie) dobře zdokumentována, kauzativní molekulární mechanismy zůstávají neznámé. K vyřešení těchto otázek naše skupina a další začali provádět podrobná hodnocení imunologické rekonstituce po HCT včetně aplikace nových technologií hlubokého sekvenování receptoru T lymfocytů (TCR) a receptoru B lymfocytů (BCR)30,48-54. Tyto technologie umožňují zkoumání šířky a hloubky potransplantační imunitní rekonstituce na úrovni molekulárních detailů, které dříve nebyly možné, a jsou příslibem prohloubení našeho porozumění dopadu infekčních patogenů na globální imunitní zdraví a imunitní rekonstituci. Široká aplikace těchto technologií a jejich průnik s podrobným hodnocením imunitního fenotypu a funkce může poskytnout nové poznatky o stavu imunitního zdraví u pacientů po transplantaci a je příslibem identifikace pacientů, kteří potřebují nové intervence ke zlepšení jejich potransplantačních operací. imunitní rekonstituce.

Cílem studie PREDICT je aplikovat systémově-biologický přístup umožňující přesnou diagnostiku klíčových imunologických výsledků po transplantaci. Tento přístup prohloubí naše chápání molekulárních mechanismů, které řídí nejsmrtelnější potransplantační komplikace, a poslouží jako kritická platforma, na níž lze navrhovat paradigmata léčby pro pacienty po transplantaci založená na důkazech.

Buněčná terapie: Nové adoptivní buněčné terapie stále častěji vstupují do klinických studií a jsou dostupné jako biologické přípravky schválené FDA, čímž poskytují terapeutickou možnost pro dříve refrakterní pacienty. Toto široké a vzrušující pole zahrnuje T buňky chimérického antigenního receptoru (CAR) namířené proti různým antigenům55, T buňky geneticky modifikované tak, aby exprimovaly TCR56,57, cytokiny stimulované NK-buňky58, stejně jako přístupy proti nádorovým vakcínám s endogenním, ozářeným nádorem. vzorky59 nebo imunitní buňky pulzované nádorovým antigenem.60 Chimérické antigen-receptorové T buňky vedly k dramatickým reakcím, zejména u pacientů s CD19+ B-buněčnými malignitami61-64, což vedlo ke schválení několika produktů FDA. Zatímco zpočátku lze dosáhnout bezprecedentních klinických remisí, přístup je často limitován trvanlivostí odpovědi a perzistencí CAR T buněk s EFS 50 % za 12 měsíců po infuzi61, mechanismy úniku z nádoru65 a významnou toxicitou zahrnující syndrom uvolnění cytokinů, neurologickou toxicitu66 . V kontextu terapie CAR T buňkami byly identifikovány klíčové faktory pro úspěšnou aplikaci a zahrnují začlenění kostimulačního signalizačního mechanismu67,68, asociaci in vivo expanze CAR T buněk s odpovědí69 a příspěvek fenotypových podskupin T buněk se schopností proliferovat a přetrvávat dlouhodobě70. Kromě toho byly získány důležité poznatky o úloze IL-6 a IL-1 při syndromu uvolňování cytokinů a neurotoxicitě71,72 a o příspěvku pan-T buněčného infiltrátu a vysokých hladin cytokinů v CNS jako mediátorů neurotoxicity73. naše skupina a další. Existuje však významná nenaplněná potřeba uplatňovat systematický přístup zkoumající determinanty úspěšné reakce, toxicity, interakce s endogenním imunitním systémem a krátkodobých a dlouhodobých účinků intervencí zaměřených na snížení toxicity, jako je podávání IL6R- antagonista Tocilizumab nebo blokáda IL-174.

V této studii se snažíme systematicky zkoumat charakteristiky produktů buněčné terapie, evoluci po podání in vivo a chování v různých kompartmentech, jako je periferní krev, kostní dřeň, CNS a případně tkáně a jejich souhra s endogenním imunitním systémem. Bude použita jednobuněčná transkriptomika spojená se sekvenováním TCR (pokud je to možné sekvenováním BCR) a fenotypovou charakterizací přenesených a endogenních imunitních buněk, jakož i analýzou secernovaných imunitních faktorů, jako jsou cytokiny, chemokiny a protilátky v plazmě, které budou korelovány s klinickými odpověďmi. . Tento nezaujatý, systematický přesný diagnostický přístup umožní identifikaci kritických drah, které jsou společné nebo odlišné v závislosti na povaze buněčného terapeutického přístupu, cíle a chorobných entit a souvisejících nebo oddělitelných od nežádoucích toxicit. To bude kriticky informovat budoucí racionální design buněčných terapeutik a informovat o možných terapeutických intervencích po podání buněčné terapie.

Reakce na vakcínu: Společným tématem mezi příjemci transplantovaných kmenových buněk a solidních orgánů, pacienty se současným nebo předchozím maligním onemocněním a pacienty s autoimunitním nebo revmatologickým onemocněním, včetně IBD, je narušená imunitní regulace, která je často spojena s účinkem léčby modifikující imunitu. včetně ozařování, chemoterapie a dlouhodobé imunosuprese. 15 % příjemců transplantovaných solidních orgánů je hospitalizováno s onemocněním, kterému lze předcházet vakcínou, v prvních pěti letech po transplantaci navzdory opatřením k imunizaci těchto pacientů (Feldman et al., 2019), což je v souladu se studiemi ukazujícími zhoršené reakce na vakcíny v tito pacienti (Madan et al., 2008; Mazzone et al., 2004). Příjemci HCT reagují na očkování v různé míře, ale nedosahují stejné velikosti odpovědi jako u zdravých kontrol a mohou mít další změněné odpovědi, pokud mají také GVHD (Avetisyan et al., 2008; Shalabi et al., 2019). Bylo také prokázáno, že pacienti s revmatologickým nebo autoimunitním onemocněním mají zhoršenou odpověď na konkrétní vakcíny, zejména pokud jsou na imunomodulačních látkách, jako je blokáda TNFalfa (Dell' Era et al., 2011). Studie u dětí, které přežily rakovinu, naznačují, že poškození imunity může přetrvávat i po vyřešení onemocnění; Pacienti, kteří přežili dětskou leukémii, kteří nedostávají HCT, mají po dokončení léčby zhoršenou humorální a adaptivní imunitu (Perkins et al., 2017; Top et al., 2020) a někteří pacienti nereagují a jiní mohou mít slábnoucí imunitu (Nilsson et al. ., 2002; Top et al., 2020) navzdory pokusům o přeočkování. Vzhledem k tomu, že úsilí o imunizaci proti SARS-CoV-2 se rozšíří, bude mít přehled o reakci na vakcínu u imunokompromitovaných pacientů zásadní význam pro informování o účinnějších strategiích ochrany této populace před závažným onemocněním COVID-19, které lze extrapolovat na jiné patogeny, kterým lze předcházet vakcínou.

V této studii navrhujeme použít systematický přístup k longitudinálnímu profilu humorálních a antigenně specifických T a B buněčných odpovědí po vakcinaci SARS-CoV-2 u pacientů s širokým spektrem onemocnění modifikujících imunitu. Vzorky krve pacientům budou odebírány před a v pravidelných intervalech po očkování. Budeme hodnotit trvanlivost a velikost dlouhodobých protilátkových odpovědí pomocí izotypově specifických ELISA a stanovení neutralizačních protilátek. Vysokoparametrová průtoková cytometrie a scRNAseq umožní fenotypování antigen-specifických T a B buněčných paměťových buněk s vysokým rozlišením a také analýzu repertoáru, která může ovlivnit pravděpodobnost imunitního úniku u očkovaných pacientů. Nakonec nám tato studie umožní určit, zda klonované protilátky nebo sérum od pacientů s imunitní dysregulací jsou méně schopné neutralizovat virové varianty, což poskytne pohled na to, zda snížená klonální diverzita u pacientů může vést k menší ochraně proti virovým variantám.