Præcisionsdiagnostik ved inflammatorisk tarmsygdom, cellulær terapi og transplantation (The PREDICT Trial) (PREDICT)

Hypoteser:

Hypotese #1: Efterforskerne antager, at de kan definere de molekylære mekanismer, der er ansvarlige for inflammatorisk tarmsygdom (IBD) og gastrointestinal (GI) akut GVHD og differentiere den fra andre inflammatoriske lidelser ved at bruge avanceret immunologisk analyse, herunder flowcytometri, TCR dyb sekventering og transkriptomi .

Hypotese #2: Efterforskerne antager yderligere, at longitudinelle systembaserede immunologiske analyser vil muliggøre patientspecifik bestemmelse af den molekylære udvikling af IBD såvel som akut og kronisk GVHD samt post-transplantationsdefekter i beskyttende immunitet, og bestemme hvilke veje, når forstyrret, kan forårsage klinisk sygdom. Opdagelsen af ​​disse veje vil føre til forbedrede diagnostiske, prognostiske og behandlingstilgange og til personlig terapeutisk beslutningstagning for patienter, der gennemgår hæmatopoietisk stamcelletransplantation (HCT).

Hypotese #3: Vi antager, at vi kan definere de molekylære mekanismer, fænotypiske og funktionelle immunologiske karakteristika involveret i forskellige determinanter af adoptive cellulære terapier, herunder effektiviteten, levetiden og toksiciteten forbundet med cellulær terapi. Longitudinel karakterisering af cellulære terapeutika og det endogene immunrespons, de fremkalder ved hjælp af avanceret immunologisk analyse, herunder flowcytometri, massespektrometri, TCR dyb sekventering og enkeltcellet transkriptomik vil tillade identifikation og skelnen mellem veje, der er kritiske for effektivitet og toksicitet, og muliggøre efterfølgende terapeutisk modulering.

Hypotese #4: Vi antager, at forskelle i tarmmikrobiomet hos patienter med IBD og modtagere af HCT spiller en stor rolle i sygdommens sværhedsgrad og overordnede kliniske resultater i begge sygdomme (f. bakteriæmi, uforklarlig feber, dødelighed). Den longitudinelle karakterisering af tarmmikrobielle samfund ved næste generations sekventering vil give mulighed for påvisning af sekventielle mikrobielle ændringer, der falder sammen med observerede kliniske ændringer. opdagelsen af ​​væsentlige ændringer i mikrobiomet, som gentagne gange observeres med et bestemt klinisk resultat, vil føre til en bedre mekanistisk forståelse af dets patofysiologi og informere fremtidige diagnostiske og forebyggende tilgange.

Hypotese #5: Vi antager, at immunforstyrrelser forbundet med en bred vifte af lidelser vil ændre immunresponset på vacciner, hvilket øger modtageligheden for infektionssygdomme i disse populationer. Specifikt kan HCT- og solidorgantransplantationsmodtagere samt patienter med aktiv eller nylig malignitet eller autoimmune sygdomme have reduceret T- og B-cellerespons på SARS-CoV-2-vaccination på grund af virkningen af ​​sygdomspatofysiologi eller behandlingsregimer på immunfunktion. Omfattende serologisk analyse, flowcytometri med høj parameter og T- og B-celle RNA-sekventering vil muliggøre longitudinel analyse af neutraliserende antistoftitere og antigenspecifik T- og B-celleudvidelse, fænotype, diversitet og overlevelse efter vaccination i disse patientpopulationer, samt i relaterede og ikke-relaterede sunde kontroller. Disse data vil give mekanistisk indsigt i, hvordan immunsvækkelse i disse lidelser bidrager til dårlige reaktioner på infektioner. da SARS-CoV-2 er et patogen, som en stor del af befolkningen forbliver naiv overfor, repræsenterer dette en unik mulighed for at studere immunresponset på en ny udfordring hos immunkompromitterede individer. Desuden vil disse resultater informere folkesundhedsretningslinjer for, hvordan man kan forbedre foranstaltninger til at beskytte sårbare befolkningsgrupper mod sygdomme, der kan forebygges.

Mål:

Specifikt mål #1: At identificere de mekanismer, der er specifikke for IBD og GI akut GVHD og afgrænse det fra andre inflammatoriske lidelser.

Mål 1: Udfør flowcytometri, TCR dyb sekventering og hel transkriptomanalyse på T-celler oprenset fra GI-vævsprøver taget fra patienter, der gennemgår endoskopi for formodet GI GVHD, inflammatorisk tarmsygdom (IBD) og funktionel gastrointestinal sygdom (FGID).

Mål 2: Udfør flowcytometri, TCR dyb sekventering og transkriptomanalyse på T-celler fra det perifere blod på tidspunktet for endoskopi hos patienter diagnosticeret med GI GVHD, IBD og FGID.

Specifikt mål #2: Karakterisere den immunologiske dysregulering, der er ansvarlig for IBD, akut GVHD, kronisk GVHD og defekter i beskyttende immunitet hos patienter, der gennemgår HCT.

Mål 1: Udfør longitudinel immunanalyse på T-celler og B-celler oprenset fra patienter med IBD og dem, der gennemgår allogen HCT. For transplanterede patienter vil vi sammenligne T- og B-celleimmunitet hos patienter, der udvikler akut og kronisk GVHD, tilbagefald og infektiøse komplikationer efter transplantation og sammenligne med patienter uden disse komplikationer.

Mål 2: Udfør mikrobiomanalyse i længderetningen hos patienter med IBD og dem, der gennemgår HCT for at bestemme virkningen af ​​mikrobiomændringer i udviklingen af ​​post-transplantationskomplikationer.

Specifikt mål #3: Identificere de molekylære og cellulære immunologiske mekanismer, der er involveret i at bestemme det kliniske respons på cellulære terapier og skelne veje, der er kritiske for en vellykket antitumorrespons, fra dem, der er involveret i bivirkninger.

Mål 1: Karakteriser det cellulære produkt før administration og spor dets fordeling, kinetik, persistens og funktion på langs in vivo i patientens perifere blod og, når det er relevant, knoglemarv, CSF og andet væv ved hjælp af qPCR-baseret transgendetektion (hvis relevant). flowcytometri, massecytometri, TCR dyb sekventering og hel transkriptomanalyse på T-celler og andre immunceller indeholdt i det cellulære produkt.

Mål 2: Undersøg på langs af celleterapiens samspil med det endogene immunsystem og afgræns den endogene immunresponss rolle i cellulær terapis effektivitet, persistens og toksicitet ved brug af flowcytometri, massecytometri, TCR dyb sekventering, analyse af hele transkriptomer om endogene immunceller og analyse af opløselige faktorer og antistoffer.

Specifikt mål #4: Karakterisere den antigenspecifikke adaptive immunrespons på SARS-CoV-2-vaccination hos patienter med immunforstyrrelser på grund af cancer, transplantation eller autoimmun sygdom og identificere mekanismer, der ligger til grund for svækket generering af holdbar immunitet.

Mål 1: Udfør omfattende longitudinel analyse af serologisk immunitet før og efter vaccination, herunder for at boostere vacciner, hos patienter og raske kontroller, herunder vurdering af SARS-CoV-2-specifikke antistofniveauer og neutraliserende antistoftitre.

Mål 2: Brug højparameter flowcytometri, enkeltcellet RNA-sekventering (scRNAseq) og T- og B-celle-repertoireanalyse til at karakterisere den langsgående udvikling af antigenspecifik T- og B-cellehukommelse til SARS-CoV-2 efter vaccination og efterfølgende boostervacciner hos patienter og raske kontroller.

Mål 3: Vurder evnen af ​​sera og klonede antistoffer fra patienter til at reagere på at binde og neutralisere virale varianter sammenlignet med raske kontrollers.

Baggrund og betydning:

IBD: Inflammatorisk tarmsygdom (IBD), som omfatter Crohns sygdom (CD) og Colitis ulcerosa (UC), er en kronisk kompleks gastrointestinal (GI) autoimmun tilstand, der påfører 1,4 millioner mennesker i USA1. Forekomsten og prævalensen af ​​både CD og UC er stigende over tid og omfatter større områder af verden1,2. Derudover omfatter pædiatrisk IBD 25% af al diagnosticeret IBD, hvilket henviser barnet til en levetid med mave-tarmsygdom og udsættelse for immunsuppression, især i en periode beregnet til vækst og udvikling. På trods af igangværende forskning i patogenesen og genetiske abnormiteter, er mekanismen bag IBD udvikling og progression ikke godt forstået. Standardbehandlinger er stadig afhængige af steroider, anden ikke-specifik immunsuppression (såsom methotrexat og azathioprin) og anti-TNF biologiske lægemidler. Selvom nyere terapier såsom midler, der blokerer cytokiner og leukocythandel dukker op, er der ikke identificeret nogen universelt vellykkede behandlinger. Således fortsætter tilbagefaldende former for IBD med at føre til systemisk kompromittering af ernæringsabsorptionskapacitet, anæmi og ofte til behovet for kirurgiske indgreb. At dechifrere de mekanismer, der driver de unikke undertyper af IBD (selv inden for UC og CD) og derefter optimere behandling baseret på den underliggende systemiske dysregulering er et kritisk udækket behov i feltet. Mens den underliggende immunmekanisme for IBD forbliver ubestemt, er der betydelige data, der tyder på, at IBD kan repræsentere et uhensigtsmæssigt immunrespons mod selvantigener og kommensal mikrobiota i en genetisk modtagelig vært3. Murine colitis-modeller antyder således, at slimhindebetændelse skyldes patologiske T-hjælper-(Th)-celleresponser sammen med regulatoriske celledefekter. Disse data er fremkommet fra eksperimenter med IL-2-deficiente mus4, IL-10-deficiente mus5, TGF-beta6 og TGF-betaGRII dominante negative transgene mus7. Patogenesen inkluderer også en overdrivelse af effektorcelleresponser, som er opstået fra eksperimenter i Stat4 transgene mus8 og TNFARE mutant mus9. Senere tyder human cytokinanalyse på, at på trods af kliniske ligheder viser hver undertype af IBD karakteristiske cytokinprofiler10. Selvom indledende undersøgelser er begyndt at målrette mod specifikke effektor-T-celle-veje11, er anvendelsen af ​​målorgan-transkriptomik i sin vorden, og individuelle målrettede veje er stadig uhåndgribelige.

HCT: Allogen HCT er en effektiv behandling til patienter med maligne og ikke-maligne hæmatologiske sygdomme. Denne behandling er imidlertid kompliceret med høje morbiditets- og dødelighedsrater, der begrænser dens bredere anvendelse. De førende årsager til post-transplantation morbiditet og dødelighed omfatter akut og kronisk GVHD, tilbagefald og infektionssygdom. Målet med PREDICT-forsøget er at anvende en systemtilgang til at forstå de mekanismer, der driver disse komplikationer, således at evidensbaserede behandlingsstrategier kan udtænkes.

Akut GVHD: Akut GVHD medieres af donor-afledte allo-reaktive T-celler, der bliver aktiveret og resulterer i cytotoksicitet mod værtsceller12,13 såvel som cytokin-medieret vævsskade. Moderat til svær akut GVHD kan forekomme hos op til 60 % af patienterne, der gennemgår HCT, og de mere alvorlige former er blevet forbundet med dødelighedsrater >50 %14-17. De mest almindelige steder for den immunmedierede vævsskade er leveren, huden og mave-tarmkanalen (GI). GI GVHD forekommer hos 40-50 % af HCT-patienter og er hovedårsagen til morbiditet og dødelighed af denne sygdom17.

Diagnosen GI GVHD er afledt af kliniske og histopatologiske fund. GVHD kan forekomme i både den øvre og nedre mave-tarmkanal, hvilket fører til symptomer på diarré, mavesmerter, kvalme, opkastning og/eller anoreksi12. Histopatologiske diagnostiske kriterier for GI GVHD omfatter identifikation af kryptcelleapoptose, kryptødelæggelse og/eller slimhinde-denudation18. Desværre er sværhedsgraden af ​​GVHD på histologi dårligt korreleret med det kliniske forløb af sygdommen.

Mens GI GVHD er en almindelig komplikation efter HCT, er der stadig mange barrierer for dens konsekvente og nøjagtige diagnose. For det første afhænger diagnosen af ​​passende vævsprøver. Synlige læsioner er ofte fraværende19, og endoskopiske fund kan være diffuse og uspecifikke. Der er heller ingen konsensus om den optimale placering af GI-kanalen for biopsier eller antallet af biopsier, der er nødvendige for at sikre en diagnose. Der er også hyppig uoverensstemmelse mellem biopsiprøver fra den øvre og nedre GI-kanal20. For det andet kan patienter, der præsenterer tidligt i forløbet af GVHD, have subtile histopatologiske fund, som kan være savnet eller endnu ikke til stede. Ved begyndelsen af ​​GVHD kan få apoptotiske celler ses, og tab af krypt og slimhindeskader kan endnu ikke være sket18. Endelig er der også forvirrende faktorer, der kan føre til fejldiagnosticering af GVHD, som inkluderer konditioneringsregimerelateret toksicitet, samtidige infektioner og medicin, som alle kan forårsage fokal betændelse i mave-tarmkanalen. I de første 20 dage efter et myeloablativt konditioneringsregime kan der ses diffus apoptose, der efterligner akut GVHD21. Clostridium difficile og cytomegalovirusinfektioner kan også have lignende kliniske og histopatologiske præsentationer22. Brug af mycophenolatmofetil23 og protonpumpehæmmere24 er også blevet fundet forbundet med GI-kanal apoptose, der kan fejldiagnosticeres som GVHD. Alle disse faktorer fører til den høje grad af inter-observatørvariabilitet i den histologiske diagnose af GVHD18,25 og dårlig korrelation med de kliniske observationer, hvilket illustrerer behovet for mere følsomme og specifikke diagnosemetoder.

Der har været nyere fremskridt i identifikation af biomarkører i GVHD, der har diagnostisk og prognostisk betydning. IL-8, IL-2-receptor-alfa, tumornekrosefaktor-receptor-1 (TNF-1), hepatocytvækstfaktor (HGF), elafin, regenererende ø-afledt 3-alpha (reg-3alpha), TIM3, IL-6 , ST2, B-celleaktiverende faktor (BAFF), IL-33, CXCL10 og CXCL11 har alle vist sig at have nytte til at forudsige udviklingen af ​​GVHD26-28. Selvom disse biomarkører er blevet identificeret, er de ikke blevet grundigt valideret og er endnu ikke blevet klinisk vedtaget som en guide til at ændre behandling. Desuden er de hidtil opdagede biomarkører ofte resultatet af forstyrrelser i nedstrømsvejene, og opdagelsen af ​​den opstrøms dysregulering, der forekommer tidligere i sygdomsforløbet, kan være værdifuld i udviklingen af ​​diagnostiske eller prognostiske modeller, der kan føre til forsøg med det formål at ændre det naturlige forløb af sygdommen. sygdommen.

Vores gruppe har tidligere vist, at vi ved at bruge avanceret immunologisk analyse, herunder flowcytometri og hel transkriptomanalyse, kan identificere tidligere ikke-genkendte molekylære veje aktive i GVHD29-31. Vi forventer, at vi ved at bruge en systemimmunologisk tilgang til patienter med akut GVHD vil være i stand til at identificere veje, der har diagnostisk og prognostisk værdi. Dette kan forbedre vores diagnostiske kapacitet og vigtigst af alt, give os mulighed for at individualisere behandlingen af ​​patienter baseret på deres specifikke immunologiske profiler.

Kronisk GVHD: CGVHD forekommer hos 40-60 % af transplantationspatienterne32-35, hvor forekomsten af ​​denne sygdom er steget inden for de sidste 2 årtier36 forårsager kronisk GVHD betydelig dødelighed, og hos de patienter, der overlever, kan det resultere i dybtgående effekter på livskvaliteten37 -40. På trods af den øgede hyppighed af kronisk GVHD, mangler der stadig nøjagtig diagnose og evidensbaseret terapi. Mens kroniske GVHD-biomarkører er blevet identificeret, er der således endnu ikke nogen, der kvalificerer sig til klinisk anvendelse41. Desuden repræsenterer disse biomarkører ofte endestadie-pathway-forstyrrelser og kan skyldes uspecifik inflammation og vævsskade såvel som modregulerende mekanismer. Ud over udfordringerne i diagnosticering er der også betydelige behandlingsudfordringer: Behandling af kronisk GVHD har således ikke ændret sig væsentligt i løbet af de seneste årtier. Førstelinjesbehandling forbliver kortikosteroider med eller uden calcineurinhæmmere (CNI'er)42-44, og desværre vil cirka 50 % af patienterne fejle og kræve andenlinjebehandling45,46 med fejlfri overlevelse 2 år efter andenlinjebehandling kun på 25 % 47. Disse data understreger de betydelige udækkede behov på dette felt, både for molekylær diagnostik og evidensbaserede behandlingsparadigmer.

Beskyttende immunitet: Ud over udfordringerne ved akut og kronisk GVHD står patienter, der gennemgår HCT og dem med IBD, også over for andre toksiciteter, hvoraf mange er relateret til dysfunktionel immunrekonstitution efter transplantation. Men selvom fænomenologien med de mange defekter i beskyttende immunitet (både mod infektiøse patogener og mod leukæmi-tilbagefald) er veldokumenteret, forbliver de forårsagende molekylære mekanismer ukendte. For at løse disse spørgsmål er vores gruppe og andre begyndt at udføre detaljerede vurderinger af immunologisk rekonstitution efter HCT, herunder anvendelse af nye T-cellereceptorer (TCR) og B-cellereceptorer (BCR) dyb-sekventeringsteknologier30,48-54. Disse teknologier gør det muligt at undersøge bredden og dybden af ​​post-transplantations immunrekonstitution på et niveau af molekylære detaljer, som ikke tidligere var muligt, og lover at uddybe vores forståelse af virkningen af ​​infektiøse patogener på global immun sundhed og immunrekonstitution. Den udbredte anvendelse af disse teknologier og deres skæringspunkt med detaljeret vurdering af immun fænotype og funktion kan give ny indsigt om tilstanden af ​​immunsundhed hos transplanterede patienter og har løftet om at identificere patienter med behov for nye indgreb for at forbedre deres post-transplantation immunrekonstitution.

Målet med PREDICT-studiet er at anvende en systembiologisk tilgang til at muliggøre præcisionsdiagnostik for de vigtigste immunologiske resultater efter transplantation. Denne tilgang vil uddybe vores forståelse af de molekylære mekanismer, der driver de mest dødelige post-transplantationskomplikationer, og tjene som en kritisk platform til at designe evidensbaserede behandlingsparadigmer for transplanterede patienter.

Cellulær terapi: Nye adoptive celleterapier går i stigende grad ind i kliniske forsøg og er tilgængelige som FDA godkendte biologiske lægemidler, hvilket giver en terapeutisk mulighed for tidligere refraktære patienter. Dette brede og spændende felt omfatter kimæriske-antigenreceptor (CAR) T-celler rettet mod en række forskellige antigener55, T-celler genetisk modificeret til at udtrykke TCRs56,57, cytokinstimulerede NK-celler58, såvel som tumorvaccinetilgange med endogene, bestrålede tumorer prøver59 eller immunceller pulseret med tumorantigen.60 Kimæriske antigen-receptor T-celler har ført til dramatiske reaktioner, især hos patienter med CD19+ B-celle malignitet61-64, hvilket har ført til FDA-godkendelse af flere produkter. Mens hidtil usete kliniske remissioner kan opnås initialt, er tilgangen ofte begrænset af holdbarheden af ​​responsen og CAR T-cellepersistens med en EFS på 50 % 12 måneder efter infusion61, tumorudslipsmekanismer65 og signifikant toksicitet, der involverer cytokinfrigivelsessyndrom, neurologisk toksicitet66 . I forbindelse med CAR T-celleterapi er nøglefaktorer for vellykket anvendelse blevet identificeret og inkluderer inkorporering af en costimulerende signalmekanisme67,68, association af in vivo CAR T-celleudvidelse med respons69 og bidrag fra T-cellefænotypiske undergrupper med kapacitet til at proliferere og vedvare på lang sigt70. Derudover er der opnået vigtig indsigt i rollerne af IL-6 og IL-1 i cytokinfrigivelsessyndrom og neurotoksicitet71,72 og bidraget fra et pan-T-celleinfiltrat og høje cytokinniveauer i CNS som mediatorer af neurotoksicitet 73 vores gruppe og andre. Der er imidlertid et betydeligt udækket behov for at anvende en systematisk tilgang, der udspørger determinanterne for et vellykket respons, toksicitet, interaktion med det endogene immunsystem og kort- og langsigtede virkninger af interventioner, der sigter mod at reducere toksicitet, såsom administration af IL6R- antagonist Tocilizumab eller IL-1 blokade74.

I denne undersøgelse sigter vi mod systematisk at undersøge egenskaberne af celleterapiprodukter, udvikling efter administration in vivo og adfærd i forskellige kompartmenter såsom perifert blod, knoglemarv, CNS og hvis relevant væv og deres samspil med det endogene immunsystem. Enkeltcellet transkriptomik, koblet med TCR-sekventering (hvis relevant BCR-sekventering) og fænotypisk karakterisering af overførte og endogene immunceller samt analyse af udskilte immunfaktorer såsom cytokiner, kemokiner og antistoffer i plasmaet vil blive anvendt og korreleret med kliniske responser . Denne uvildige, systematiske præcisionsdiagnostiske tilgang vil tillade identifikation af kritiske veje, som er fælles eller adskilte afhængigt af arten af ​​den celleterapeutiske tilgang, mål- og sygdomsenheder og associerede eller adskillelige fra uønskede toksiciteter. Dette vil kritisk informere fremtidigt rationelt design af cellulær terapi og informere om mulige terapeutiske indgreb efter administration af celleterapi.

Vaccineresponser: Et almindeligt tema blandt modtagere af stamcelle- og organtransplanterede, patienter med nuværende eller tidligere malignitet og patienter med autoimmun eller reumatologisk sygdom, herunder IBD, er nedsat immunregulering, som ofte forværres af effekten af ​​immunmodificerende behandlinger , herunder stråling, kemoterapi og langvarig immunsuppression. 15 % af solide organtransplanterede modtagere er indlagt med en vaccineforebyggelig sygdom i de første fem år efter transplantationen på trods af foranstaltninger til immunisering af disse patienter (Feldman et al., 2019), hvilket er i overensstemmelse med undersøgelser, der viser nedsat respons på vacciner i disse patienter (Madan et al., 2008; Mazzone et al., 2004). HCT-modtagere reagerer i varierende grad på vaccination, men har ikke samme omfang af respons som hos raske kontroller og kan have yderligere ændrede responser, hvis de også har GVHD (Avetisyan et al., 2008; Shalabi et al., 2019). Patienter med reumatologisk eller autoimmun sygdom har også vist sig at have nedsat respons på bestemte vacciner, især hvis de er på immunmodulerende midler såsom TNFalpha-blokade (Dell' Era et al., 2011). Undersøgelser af børnekræftoverlevere tyder på, at immunsvækkelse kan fortsætte ud over sygdomsopløsning; pædiatriske leukæmioverlevere, som ikke modtager HCT, har nedsat humoral og adaptiv immunitet ved behandlingens afslutning (Perkins et al., 2017; Top et al., 2020), og nogle patienter reagerer ikke, og andre kan have aftagende immunitet (Nilsson et al. ., 2002; Top et al., 2020) på trods af re-vaccinationsforsøg. Efterhånden som immuniseringsindsatsen mod SARS-CoV-2 bliver udbredt, vil indsigt i vaccineresponset hos immunkompromitterede patienter være afgørende for at informere mere effektive strategier til at beskytte denne befolkning mod alvorlig COVID-19, som kan ekstrapoleres til andre vaccineforebyggelige patogener.

I denne undersøgelse foreslår vi at bruge en systematisk tilgang til langsgående profilering af humorale og antigenspecifikke T- og B-celleresponser efter SARS-CoV-2-vaccination hos patienter med en bred vifte af immunmodificerende sygdomme. Blodprøver fra patienter vil blive indsamlet før og med jævne mellemrum efter vaccination. Vi vil vurdere holdbarheden og størrelsen af ​​langsigtede antistofresponser ved hjælp af isotypespecifikke ELISA'er og neutraliserende antistofassays. Højparameter flowcytometri og scRNAseq vil muliggøre højopløsningsfænotypning af antigenspecifikke T- og B-cellehukommelsesceller samt repertoireanalyse, som kan påvirke sandsynligheden for immunudslip hos vaccinerede patienter. Endelig vil denne undersøgelse give os mulighed for at bestemme, om klonede antistoffer eller serum fra patienter med immun dysregulering er mindre i stand til at neutralisere virale varianter, hvilket giver indsigt i, hvorvidt reduceret klonal diversitet hos patienter kan resultere i mindre beskyttelse mod virale varianter.