Diagnostica di precisione nelle malattie infiammatorie intestinali, terapia cellulare e trapianto (lo studio PREDICT) (PREDICT)

Ipotesi:

Ipotesi n. 1: gli investigatori ipotizzano di poter definire i meccanismi molecolari responsabili della malattia infiammatoria intestinale (IBD) e della GVHD acuta gastrointestinale (GI) e differenziarla da altri disturbi infiammatori utilizzando analisi immunologiche avanzate tra cui citometria a flusso, sequenziamento profondo del TCR e trascrittomica .

Ipotesi n. 2: gli investigatori ipotizzano inoltre che l'analisi immunologica basata su sistemi longitudinali consentirà la determinazione specifica del paziente dell'evoluzione molecolare dell'IBD e della GVHD acuta e cronica nonché dei difetti post-trapianto nell'immunità protettiva e determinerà quali percorsi, quando perturbato, può causare malattia clinica. La scoperta di questi percorsi porterà a migliori approcci diagnostici, prognostici e terapeutici ea decisioni terapeutiche personalizzate per i pazienti sottoposti a trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HCT).

Ipotesi n. 3: ipotizziamo di poter definire i meccanismi molecolari, le caratteristiche immunologiche fenotipiche e funzionali coinvolte nei determinanti distinti delle terapie cellulari adottive, inclusa l'efficacia, la longevità e la tossicità associate alla terapia cellulare. La caratterizzazione longitudinale delle terapie cellulari e della risposta immunitaria endogena che suscitano utilizzando analisi immunologiche avanzate tra cui citometria a flusso, spettrometria di massa, sequenziamento profondo del TCR e trascrittomica a cellula singola consentirà l'identificazione e la distinzione di percorsi critici per l'efficacia e la tossicità e consentirà la successiva modulazione terapeutica.

Ipotesi n. 4: ipotizziamo che le differenze nel microbioma intestinale dei pazienti con IBD e dei destinatari di HCT svolgano un ruolo importante nella gravità della malattia e negli esiti clinici complessivi in ​​entrambe le malattie (ad es. batteriemia, febbri inspiegabili, mortalità). La caratterizzazione longitudinale delle comunità microbiche intestinali mediante sequenziamento di nuova generazione consentirà il rilevamento di cambiamenti microbici sequenziali che coincidono con i cambiamenti clinici osservati. la scoperta di cambiamenti significativi nel microbioma che vengono ripetutamente osservati con un particolare esito clinico porterà a una migliore comprensione meccanicistica della sua fisiopatologia e informerà i futuri approcci diagnostici e preventivi.

Ipotesi n. 5: ipotizziamo che la disregolazione immunitaria associata a un'ampia gamma di disturbi altererà la risposta immunitaria ai vaccini, aggravando la suscettibilità alle malattie infettive in queste popolazioni. In particolare, i trapiantati di HCT e di organi solidi, così come i pazienti con anamnesi attiva o recente di malignità o malattie autoimmuni possono avere risposte ridotte delle cellule T e B alla vaccinazione SARS-CoV-2 a causa dell'effetto della fisiopatologia della malattia o dei regimi di trattamento su Funzione immunitaria. L'analisi sierologica completa, la citometria a flusso ad alto parametro e il sequenziamento dell'RNA delle cellule T e B consentiranno l'analisi longitudinale dei titoli anticorpali neutralizzanti e l'espansione delle cellule T e B antigene-specifiche, il fenotipo, la diversità e la sopravvivenza dopo la vaccinazione in queste popolazioni di pazienti, nonché nei controlli sani correlati e non correlati. Questi dati forniranno informazioni meccanicistiche su come la compromissione immunitaria in questi disturbi contribuisce a scarse risposte alle infezioni. poiché SARS-CoV-2 è un agente patogeno a cui gran parte della popolazione rimane ingenua, ciò rappresenta un'opportunità unica per studiare la risposta immunitaria a una nuova sfida negli individui immunocompromessi. Inoltre, questi risultati informeranno le linee guida di sanità pubblica su come migliorare le misure per proteggere le popolazioni vulnerabili dalle malattie prevenibili.

Obiettivi:

Obiettivo specifico n. 1: identificare i meccanismi specifici per IBD e GI GVHD acuto e delinearlo da altri disturbi infiammatori.

Obiettivo 1: eseguire la citometria a flusso, il sequenziamento profondo del TCR e l'analisi dell'intero trascrittoma su cellule T purificate da campioni di tessuto gastrointestinale prelevati da pazienti sottoposti a endoscopia per presunta GVHD gastrointestinale, malattia infiammatoria intestinale (IBD) e malattia gastrointestinale funzionale (FGID).

Obiettivo 2: eseguire la citometria a flusso, il sequenziamento profondo del TCR e l'analisi del trascrittoma sulle cellule T del sangue periferico al momento dell'endoscopia in pazienti con diagnosi di GI GVHD, IBD e FGID.

Obiettivo specifico #2: Caratterizzare la disregolazione immunologica responsabile di IBD, GVHD acuta, GVHD cronica e difetti dell'immunità protettiva nei pazienti sottoposti a HCT.

Obiettivo 1: eseguire un'analisi immunitaria longitudinale su cellule T e cellule B purificate da pazienti con IBD e quelli sottoposti a HCT allogenico. Per i pazienti trapiantati, confronteremo l'immunità delle cellule T e B nei pazienti che sviluppano GVHD acuta e cronica, recidiva e complicanze infettive post-trapianto e confronteremo i pazienti senza queste complicanze.

Obiettivo 2: eseguire l'analisi longitudinale del microbioma nei pazienti con IBD e in quelli sottoposti a HCT per determinare l'impatto delle alterazioni del microbioma nello sviluppo delle complicanze post-trapianto.

Obiettivo specifico n. 3: Identificare i meccanismi immunologici molecolari e cellulari coinvolti nella determinazione della risposta clinica alle terapie cellulari e distinguere i percorsi critici per una risposta antitumorale di successo da quelli coinvolti negli effetti avversi.

Obiettivo 1: caratterizzare il prodotto cellulare prima della somministrazione e monitorarne la distribuzione, la cinetica, la persistenza e la funzione longitudinalmente in vivo nel sangue periferico del paziente e, ove applicabile, nel midollo osseo, nel liquido cerebrospinale e in altri tessuti, utilizzando il rilevamento del transgene basato su qPCR (se applicabile), citometria a flusso, citometria di massa, sequenziamento profondo del TCR e analisi dell'intero trascrittoma su cellule T e altre cellule immunitarie contenute nel prodotto cellulare.

Obiettivo 2: interrogare longitudinalmente l'interazione della terapia cellulare con il sistema immunitario endogeno e delineare il ruolo della risposta immunitaria endogena nell'efficacia, persistenza e tossicità della terapia cellulare, utilizzando la citometria a flusso, la citometria di massa, il sequenziamento profondo del TCR, l'analisi dell'intero trascrittoma sulle cellule immunitarie endogene e analisi dei fattori solubili e degli anticorpi.

Obiettivo specifico n. 4: Caratterizzare la risposta immunitaria adattativa antigene-specifica alla vaccinazione SARS-CoV-2 in pazienti con disregolazione immunitaria dovuta a cancro, trapianto o malattia autoimmune e identificare i meccanismi alla base della ridotta generazione di immunità duratura.

Obiettivo 1: eseguire un'analisi longitudinale completa dell'immunità sierologica prima e dopo la vaccinazione, compresi i vaccini di richiamo, in pazienti e controlli sani, compresa la valutazione dei livelli di anticorpi specifici SARS-CoV-2 e dei titoli di anticorpi neutralizzanti.

Obiettivo 2: utilizzare la citometria a flusso ad alto parametro, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNAseq) e l'analisi del repertorio delle cellule T e B per caratterizzare lo sviluppo longitudinale della memoria delle cellule T e B antigene-specifiche a SARS-CoV-2 dopo la vaccinazione e i successivi vaccini di richiamo nei pazienti e nei controlli sani.

Obiettivo 3: Valutare la capacità dei sieri e degli anticorpi clonati dei pazienti di rispondere per legare e neutralizzare le varianti virali, rispetto a quella dei controlli sani.

Contesto e significato:

IBD: la malattia infiammatoria intestinale (IBD) che include la malattia di Crohn (CD) e la colite ulcerosa (UC), è una condizione autoimmune cronica gastrointestinale (GI) complessa che colpisce 1,4 milioni di persone negli Stati Uniti1. L'incidenza e la prevalenza sia di MC che di CU stanno aumentando nel tempo e interessando aree più vaste del mondo1,2. Inoltre, l'IBD pediatrico comprende il 25% di tutte le IBD diagnosticate, relegando il bambino a una vita di malattie gastrointestinali e all'esposizione all'immunosoppressione, specialmente durante un periodo destinato alla crescita e allo sviluppo. Nonostante la ricerca in corso sulla patogenesi e sulle anomalie genetiche, il meccanismo alla base dello sviluppo e della progressione dell'IBD non è ben compreso. Le terapie standard si basano ancora su steroidi, altri immunosoppressori non specifici (come metotrexato e azatioprina) e farmaci biologici anti-TNF. Sebbene stiano emergendo terapie più recenti come agenti che bloccano le citochine e il traffico di leucociti, non sono stati identificati trattamenti universalmente efficaci. Pertanto, le forme recidivanti di IBD continuano a portare a compromissione sistemica della capacità di assorbimento nutrizionale, anemia e, spesso, alla necessità di interventi chirurgici. Decifrare i meccanismi che guidano i sottotipi unici di IBD (anche all'interno di CU e MC) quindi ottimizzare il trattamento basato sulla disregolazione sistemica sottostante è un'esigenza critica insoddisfatta nel campo. Sebbene il meccanismo immunitario alla base dell'IBD rimanga indeterminato, vi sono dati significativi che suggeriscono che l'IBD possa rappresentare una risposta immunitaria inappropriata nei confronti degli antigeni self e del microbiota commensale in un ospite geneticamente suscettibile3. Pertanto, i modelli di colite murina suggeriscono che l'infiammazione della mucosa deriva da risposte patologiche delle cellule T helper (Th), insieme a difetti delle cellule regolatorie. Questi dati sono emersi da esperimenti su topi deficienti di IL-24, deficienti di IL-105, TGF-beta6 e topi transgenici negativi dominanti TGF-betaGRII7. La patogenesi include anche un'esagerazione delle risposte delle cellule effettrici, che sono emerse da esperimenti su topi transgenici Stat48 e topi mutanti TNFARE9. Più recentemente l'analisi delle citochine umane suggerisce che, nonostante le somiglianze cliniche, ogni sottotipo di IBD mostra profili citochinici distintivi10. Sebbene gli studi iniziali abbiano iniziato a prendere di mira specifici percorsi delle cellule T effettrici11, l'applicazione della trascrittomica degli organi bersaglio è agli inizi e i singoli percorsi mirabili sono ancora sfuggenti.

HCT: L'HCT allogenico è un trattamento efficace per i pazienti con malattie ematologiche maligne e non maligne. Tuttavia, questo trattamento è complicato con alti tassi di morbilità e mortalità che ne limitano l'applicazione più ampia. Le principali cause di morbilità e mortalità post-trapianto includono la GVHD acuta e cronica, le ricadute e le malattie infettive. L'obiettivo dello studio PREDICT è applicare un approccio sistemico alla comprensione dei meccanismi alla base di queste complicanze, in modo tale da poter elaborare strategie di trattamento basate sull'evidenza.

GVHD acuta: la GVHD acuta è mediata da cellule T allo-reattive derivate da donatori che si attivano e provocano citotossicità contro le cellule ospiti12,13 nonché danno tissutale mediato da citochine. La GVHD acuta da moderata a grave può verificarsi fino al 60% dei pazienti sottoposti a HCT e le forme più gravi sono state associate a tassi di mortalità >50%14-17. I siti più comuni del danno tissutale immuno-mediato sono il fegato, la pelle e il tratto gastrointestinale (GI). GI GVHD si verifica nel 40-50% dei pazienti con HCT ed è la principale causa di morbilità e mortalità per questa malattia17.

La diagnosi di GI GVHD deriva dai reperti clinici e istopatologici. La GVHD può manifestarsi sia nel tratto gastrointestinale superiore che in quello inferiore, portando a sintomi di diarrea, dolore addominale, nausea, vomito e/o anoressia12. I criteri diagnostici istopatologici per GI GVHD includono l'identificazione dell'apoptosi delle cellule della cripta, la distruzione della cripta e/o la denudazione della mucosa18. Sfortunatamente, la gravità della GVHD sull'istologia è scarsamente correlata con il decorso clinico della malattia.

Mentre GI GVHD è una complicanza comune dopo l'HCT, rimangono molti ostacoli alla sua diagnosi coerente e accurata. In primo luogo, la diagnosi dipende da un appropriato campionamento dei tessuti. Le lesioni visibili sono spesso assenti19 ei reperti endoscopici possono essere diffusi e aspecifici. Non vi è inoltre consenso sulla posizione ottimale del tratto gastrointestinale per le biopsie o sul numero di biopsie necessarie per garantire una diagnosi. C'è anche una frequente discordanza tra i campioni bioptici del tratto gastrointestinale superiore e inferiore20. In secondo luogo, i pazienti che si presentano precocemente nel corso della GVHD possono avere sottili reperti istopatologici che possono essere persi o non ancora presenti. All'inizio della GVHD si possono osservare poche cellule apoptotiche e la perdita della cripta e il danno della mucosa potrebbero non essersi ancora verificati18. Infine, ci sono anche fattori di confusione che possono portare alla diagnosi errata di GVHD che includono tossicità correlata al regime di condizionamento, infezioni concomitanti e farmaci che possono tutti causare infiammazione focale del tratto gastrointestinale. Nei primi 20 giorni successivi a un regime di condizionamento mieloablativo si può osservare un'apoptosi diffusa che mima la GVHD21 acuta. Anche le infezioni da Clostridium difficile e da citomegalovirus possono avere presentazioni cliniche e istopatologiche simili22. L'uso di micofenolato mofetile23 e inibitori della pompa protonica24 è stato anche trovato associato all'apoptosi del tratto gastrointestinale che può essere erroneamente diagnosticata come GVHD. Tutti questi fattori portano all'elevato grado di variabilità inter-osservatore nella diagnosi istologica di GVHD18,25 e alla scarsa correlazione con le osservazioni cliniche, illustrando la necessità di metodi di diagnosi più sensibili e specifici.

Ci sono stati recenti progressi nell'identificazione di biomarcatori nella GVHD che hanno un significato diagnostico e prognostico. IL-8, IL-2 recettore-alfa, recettore del fattore di necrosi tumorale-1 (TNF-1), fattore di crescita degli epatociti (HGF), elafina, 3-alfa derivato da isole rigeneranti (reg-3alfa), TIM3, IL-6 , ST2, fattore di attivazione delle cellule B (BAFF), IL-33, CXCL10 e CXCL11 sono stati tutti trovati utili nel predire lo sviluppo di GVHD26-28. Sebbene questi biomarcatori siano stati identificati, non sono stati ampiamente convalidati e devono ancora essere adottati clinicamente come guida per modificare il trattamento. Inoltre, i biomarcatori scoperti finora sono spesso il risultato di perturbazioni del percorso a valle e la scoperta della disregolazione a monte che si verifica prima nel corso della malattia può essere preziosa per lo sviluppo di modelli diagnostici o prognostici che potrebbero portare a sperimentazioni mirate ad alterare il corso naturale della malattia. la malattia.

Il nostro gruppo ha precedentemente dimostrato che utilizzando un'analisi immunologica avanzata inclusa la citometria a flusso e l'analisi dell'intero trascrittoma, possiamo identificare percorsi molecolari precedentemente non riconosciuti attivi in ​​​​GVHD29-31. Prevediamo che utilizzando un approccio di immunologia dei sistemi nei pazienti con GVHD acuta saremo in grado di identificare percorsi che hanno valore diagnostico e prognostico. Ciò può migliorare la nostra capacità diagnostica e, cosa più importante, permetterci di personalizzare la gestione dei pazienti in base ai loro specifici profili immunologici.

GVHD cronica: la CGVHD si verifica nel 40-60% dei pazienti trapiantati32-35 con l'incidenza di questa malattia in aumento negli ultimi 2 decenni36 la GVHD cronica causa una mortalità significativa e, nei pazienti che sopravvivono, può avere effetti profondi sulla qualità della vita37 -40. Nonostante l'aumento della frequenza della GVHD cronica, mancano ancora una diagnosi accurata e una terapia basata sull'evidenza. Pertanto, sebbene siano stati identificati biomarcatori della GVHD cronica, non ce ne sono ancora che si qualifichino per l'applicazione clinica41. Inoltre, questi biomarcatori rappresentano spesso perturbazioni del percorso terminale e possono derivare da infiammazioni non specifiche e danni ai tessuti, nonché da meccanismi controregolatori. Oltre alle sfide nella diagnosi, ci sono anche sfide terapeutiche significative: Pertanto, il trattamento della GVHD cronica non è cambiato in modo significativo negli ultimi decenni. La terapia di prima linea rimane a base di corticosteroidi con o senza inibitori della calcineurina (CNI)42-44 e sfortunatamente, circa il 50% dei pazienti fallirà e richiederà un trattamento di seconda linea45,46 con una sopravvivenza libera da insuccesso a 2 anni dopo la terapia di seconda linea che rappresenta solo il 25% 47. Questi dati sottolineano le significative esigenze insoddisfatte in questo campo, sia per la diagnostica molecolare che per i paradigmi di trattamento basati sull'evidenza.

Immunità protettiva: oltre alle sfide della GVHD acuta e cronica, i pazienti sottoposti a HCT e quelli con IBD affrontano anche altre tossicità, molte delle quali sono correlate alla ricostituzione immunitaria disfunzionale dopo il trapianto. Tuttavia, sebbene la fenomenologia dei numerosi difetti dell'immunità protettiva (sia contro i patogeni infettivi che contro le ricadute leucemiche) sia ben documentata, i meccanismi molecolari causali rimangono sconosciuti. Per rispondere a queste domande, il nostro gruppo e altri hanno iniziato a eseguire valutazioni dettagliate della ricostituzione immunologica dopo HCT, inclusa l'applicazione delle nuove tecnologie di sequenziamento profondo del recettore delle cellule T (TCR) e del recettore delle cellule B (BCR)30,48-54. Queste tecnologie consentono di indagare l'ampiezza e la profondità della ricostituzione immunitaria post-trapianto a un livello di dettaglio molecolare non precedentemente possibile e mantengono la promessa di approfondire la nostra comprensione dell'impatto dei patogeni infettivi sulla salute immunitaria globale e sulla ricostituzione immunitaria. L'ampia applicazione di queste tecnologie e la loro intersezione con una valutazione dettagliata del fenotipo e della funzione immunitaria può fornire nuove informazioni sullo stato di salute immunitaria nei pazienti trapiantati e mantiene la promessa di identificare i pazienti che necessitano di nuovi interventi per migliorare il loro post-trapianto ricostituzione immunitaria.

L'obiettivo dello studio PREDICT è applicare un approccio di biologia dei sistemi per consentire una diagnostica di precisione per i principali esiti immunologici post-trapianto. Questo approccio approfondirà la nostra comprensione dei meccanismi molecolari che guidano le complicazioni post-trapianto più mortali e fungerà da piattaforma critica su cui progettare paradigmi di trattamento basati sull'evidenza per i pazienti trapiantati.

Terapia cellulare: nuove terapie cellulari adottive stanno entrando sempre più negli studi clinici e sono disponibili come farmaci biologici approvati dalla FDA, fornendo così un'opzione terapeutica per i pazienti precedentemente refrattari. Questo campo ampio ed entusiasmante comprende le cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) dirette contro una varietà di antigeni55, le cellule T geneticamente modificate per esprimere i TCR56,57, le cellule NK stimolate dalle citochine58, nonché gli approcci del vaccino tumorale con tumore endogeno irradiato campioni59 o cellule immunitarie pulsate con antigene tumorale.60 Le cellule T chimeriche del recettore dell'antigene hanno portato a risposte drammatiche, in particolare nei pazienti con tumori maligni delle cellule B CD19+61-64, portando all'approvazione della FDA di diversi prodotti. Mentre inizialmente è possibile ottenere remissioni cliniche senza precedenti, l'approccio è spesso limitato dalla durata della risposta e dalla persistenza delle cellule CAR-T con un EFS del 50% a 12 mesi dopo l'infusione61, meccanismi di fuga del tumore65 e tossicità significativa che coinvolge la sindrome da rilascio di citochine, tossicità neurologica66 . Nel contesto della terapia con cellule CAR T, sono stati identificati i fattori chiave per un'applicazione di successo e includono l'incorporazione di un meccanismo di segnalazione costimolazione67,68, l'associazione dell'espansione delle cellule CAR T in vivo con la risposta69 e il contributo di sottogruppi fenotipici di cellule T con capacità di proliferare e persistere a lungo termine70. Inoltre, importanti approfondimenti sui ruoli di IL-6 e IL-1 nella sindrome da rilascio di citochine e nella neurotossicità71,72 e sul contributo di un infiltrato di cellule pan-T e di alti livelli di citochine nel sistema nervoso centrale come mediatori della neurotossicità73, sono stati ottenuti da il nostro gruppo e altri. Tuttavia, vi è una significativa necessità insoddisfatta di applicare un approccio sistematico che interroghi i determinanti di una risposta di successo, tossicità, interazione con il sistema immunitario endogeno e gli effetti a breve e lungo termine degli interventi volti a ridurre la tossicità come la somministrazione di IL6R- antagonista Tocilizumab o blocco di IL-174.

In questo studio miriamo a interrogare sistematicamente le caratteristiche dei prodotti di terapia cellulare, l'evoluzione dopo la somministrazione in vivo e il comportamento in diversi comparti come il sangue periferico, il midollo osseo, il sistema nervoso centrale e, se applicabile, i tessuti e la loro interazione con il sistema immunitario endogeno. La trascrittomica di singola cellula, unita al sequenziamento del TCR (sequenziamento del BCR quando applicabile) e la caratterizzazione fenotipica delle cellule immunitarie trasferite ed endogene, nonché l'analisi dei fattori immunitari secreti come citochine, chemochine e anticorpi nel plasma saranno impiegate e correlate con le risposte cliniche . Questo approccio diagnostico di precisione imparziale e sistematico consentirà l'identificazione di percorsi critici che sono comuni o distinti a seconda della natura dell'approccio terapeutico cellulare, del bersaglio e delle entità della malattia e associati o segregabili da tossicità indesiderate. Ciò informerà in modo critico la futura progettazione razionale delle terapie cellulari e informerà i possibili interventi terapeutici dopo la somministrazione della terapia cellulare.

Risposte ai vaccini: un tema comune tra i riceventi di trapianto di cellule staminali e di organi solidi, i pazienti con tumore maligno attuale o pregresso e i pazienti con malattie autoimmuni o reumatologiche, inclusa l'IBD, è l'alterazione della regolazione immunitaria, che è spesso aggravata dall'effetto dei trattamenti immuno-modificanti , incluse radiazioni, chemioterapia e immunosoppressione a lungo termine. Il 15% dei riceventi di trapianto di organi solidi è ricoverato in ospedale con una malattia prevenibile con vaccino nei primi cinque anni dopo il trapianto nonostante le misure per immunizzare questi pazienti (Feldman et al., 2019), il che è coerente con gli studi che mostrano risposte compromesse ai vaccini in questi pazienti (Madan et al., 2008; Mazzone et al., 2004). I destinatari di HCT rispondono a gradi variabili alla vaccinazione, ma non montano la stessa entità di risposta dei controlli sani e possono avere risposte ulteriormente alterate se hanno anche GVHD (Avetisyan et al., 2008; Shalabi et al., 2019). È stato anche dimostrato che i pazienti con malattie reumatologiche o autoimmuni hanno risposte compromesse a particolari vaccini, specialmente se trattati con agenti immunomodulatori come il blocco del TNFalfa (Dell' Era et al., 2011). Gli studi sui sopravvissuti al cancro infantile suggeriscono che la compromissione immunitaria può persistere oltre la risoluzione della malattia; i sopravvissuti alla leucemia pediatrica che non ricevono HCT hanno un'immunità umorale e adattativa compromessa al completamento del trattamento (Perkins et al., 2017; Top et al., 2020), e alcuni pazienti non rispondono, mentre altri possono avere un'immunità calante (Nilsson et al. ., 2002; Top et al., 2020) nonostante i tentativi di rivaccinazione. Man mano che gli sforzi di immunizzazione contro SARS-CoV-2 si diffondono, le informazioni sulla risposta al vaccino nei pazienti immunocompromessi saranno fondamentali per informare strategie più efficaci per proteggere questa popolazione dal COVID-19 grave, che può essere estrapolato ad altri agenti patogeni prevenibili con il vaccino.

In questo studio proponiamo di utilizzare un approccio sistematico per profilare longitudinalmente le risposte delle cellule T e B specifiche dell'antigene e umorali dopo la vaccinazione SARS-CoV-2 in pazienti con un'ampia gamma di malattie immuno-modificanti. I campioni di sangue dei pazienti saranno raccolti prima ea intervalli regolari dopo la vaccinazione. Valuteremo la durata e l'entità delle risposte anticorpali a lungo termine utilizzando ELISA isotipo-specifici e saggi anticorpali neutralizzanti. La citometria a flusso ad alto parametro e scRNAseq consentiranno la fenotipizzazione ad alta risoluzione delle cellule di memoria delle cellule T e B specifiche dell'antigene, nonché l'analisi del repertorio, che può influire sulla probabilità di fuga immunitaria nei pazienti vaccinati. Infine, questo studio ci consentirà di determinare se gli anticorpi clonati o il siero di pazienti con disregolazione immunitaria sono meno in grado di neutralizzare le varianti virali, fornendo informazioni sul fatto che una ridotta diversità clonale nei pazienti possa comportare una minore protezione contro le varianti virali.