Asociace mezi složením fekálních mikrobiot, koncentrací metabolitů a hladinami indoxylsulfátu

Pacienti a návrh studia

Šedesát HD pacientů bude zapsáno z dialyzační jednotky, renální divize Tungs 'Taichung Metroharbour Hospital. Písemný informovaný souhlas s účastí na studii je získán od každého účastníka poté, co byl informován o návrhu studie a cílech. Experimentální protokol pošle ke schválení etickým výborům IRB. Kritéria pro zařazení jsou ve věku 18–80 let a diagnostikována s CKD stadií V (v současné době je léčba hemodialýzou> 3 měsíce). Mezi kritéria vyloučení patřila těhotná nebo ošetřovatelská žena; Pacienti s transplantací ledvin, závažnými infekcemi, těžkými srdečními chorobami a onemocněními jater, malignitou, autoimunitními poruchami, těžkou podvýživou; spotřeboval jakýkoli typ před nebo probiotik nebo měl antibiotickou terapii do 1 měsíce od zahájení studie; diagnostikoval syndrom dráždivého tračníku, Crohnova choroba nebo ulcerativní kolitida; Přijímající nebo obdrželi záření střev nebo měli velkou resekci střev. Účastníci obdrží dietní pokyny a jsou povzbuzováni, aby udržovali stabilní stravovací příjem, který je kvantifikován nutričními dotazníky během rozhovorů s pacientem. Dotazníky shromáždily informace o týdenní množství a frekvenci spotřeby potravin a nápojů. Údaje týkající se složení živin různých potravin se získávají pomocí tabulek Institutu pro výživu a bezpečnost potravin, National Tchajwan University.

Sběr vzorků, přípravek a analýza Vzorky krve se shromažďují odděleně od každého účastníka. Vzorky krve se shromažďují po 8 až 12hodinovém období půstu pomocí zkumavek o fluoridech sodný a udržují led, dokud se nepřenášejí do výzkumné laboratoře. Jakmile jsou vzorky odstředěny při 3 000 x g po dobu 15 minut při 4 ° C. Sérum je poté přeneseno do sterilních zkumavek a uloženo při -20 ° C pro budoucí analýzu.

Měříme sérové ​​hladiny acetátu, propionátu, butyrátu a Varete, spolu s SCFA s větveným řetězcem, jako je isobutyrát a isovalát. Tyto profily metabolitu jsou analyzovány pomocí spektrometrie ultraperformační kapalinové chromatografické hmoty (UPLC-MS). Stručně řečeno, 100 ul každého vzorku v séru je smícháno v 1,5 ml mikrotrubic s 20 mg NaCl, 10 mg kyseliny citronové, 20 ul 1 M HC1 a 100 ul butanolu. Směs je vířena po dobu 2 minut a poté odstředěna při 18 000 x g po dobu 15 minut. Výsledný supernatant je přenesen do čerstvých mikrotrubic pro analýzu.

Měření uremických toxinů měříme spíše celkové hladiny uremických toxinů než volné úrovně. Koncentrace celkového indoxylsulfátu, p-scresylsulfátu, indol-3-octové kyseliny (IAA) a kyseliny hippurové jsou centrálně kvantifikovány pomocí dříve popsané metody [19]. Stručně řečeno, pro vazebnou soutěž, 200 μl séra, ke kterému jsme přidali 20 μl 0,50 mm 1-naftalenesulfonovou kyselinu (vnitřní standard), byl vířem promířen 250 μl 0,24M oktanoátu sodíku (vazba konkurence). Po inkubaci při inkubaci při inkubaci při pokojové teplotě pro 5min, přidali jsme 2ml studené acetonu k proteinu. Po mixování víru a odstředění při 4 ° C, 1860 × g po dobu 20 minut, byl supernatant přenesen na 12 mm x 100 mm, GL 14 skleněné zkumavky a 2 ml dichlormethan. Po míchání víru a odstředění při 4 ° C, 1860 × g pro 10 minut, bylo do HPLC přeneseno 200 μl horní vrstvy do skleněných autosamplerových lahviček. Analýza HPLC byla provedena na LC řady Agilent 1100 (Santa Clara, CA) a pro chromatografickou analýzu byl použit software Agilent Chemstations. Separace byla provedena na sloupci Zorbax SB-C18 Solv Plus HPLC (5 μm, 3,0 mm x 150 mm). V průtoku 0,6 ml/min. Mobilní fáze A je 0,2% kyseliny trifluoroctové ve vodě Milli-Q a mobilní fáze B je 0,2% kyseliny trifluoroctové v acetonitrilu. Analytická metoda sestává z isokratického běhu s 92% mobilní fází A po dobu 23 minut .. Po každém analytickém běhu následoval 1,3minutový vymývací gradient na 100% B. Teplota sloupce byla 25 ° C a teplota autosamplerového zásobníku byla 6 ° C. Analyty jsme kvantifikovali pomocí analytu ke standardnímu poměru plochy píku na vysoce výkonném detektoru fluorescence Agilent 1100 G1321A a Agilent 1100 řady UV-viditelných detektorů G1314A. Nastavení detektoru bylo λex 260 nm/λEM288NM pro p-scresylsulfát a AEX 280 nm/λEM 390NM pro indoxylsulfát, indol-3-octovou kyselinu a vnitřní standard. Kyselina hippurová byla monitorována UV-vis detektorem při 254 nm. Kvantitativní výsledky jsou získány a vypočteny z hlediska jejich koncentrací (mg/l).

Sběr vzorků profilu mikrobioty kvalifikované vzorky stolice se vyskytuje ve sterilních zmrazených trubkách subjekty a byl okamžitě transportován do laboratoře, kde byly uloženy na - 80 ° C pro další testování.

Extrakce DNA a sekvenování genomické DNA z fekálních vzorků je extrahováno pomocí rychlé sady Qiagen DNA Stool Fast (Qiagen) podle pokynů výrobce. Kvalita extrahované metagenomické DNA se hodnotí pomocí 1,0% agarózového gelového elektroforézy a spektrofotometrické analýzy (měření optické hustoty při poměru 260/280 nm). Aby byla extrahovaná DNA považována za vhodnou, musí koncentrace překročit 20 ng/μl, s poměrem 260/280 nm v rozmezí 1,8 až 2,0. Variabilní oblast 4 (V4) bakteriálního genu 16S rRNA je amplifikována polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) bakteriálními/archaálními primery 515F/806R, včetně čárových kódů pro identifikaci vzorku [20]. Výsledné amplikony jsou purifikovány pomocí soupravy extrakce gelového gelu (Thermo Scientific) a kvantifikovány pomocí testovací soupravy HS HS na fluorometru Qubit 2.0 (qubit). Knihovny sekvencí jsou připraveny pomocí soupravy Prep Knihovny Nebnext® Ultra ™ DNA pro Illumina (NEB) podle protokolu výrobce. Purifikované knihovny jsou kvantifikovány, normalizovány, sdruženy a poté se používají pro generování a sekvenování shluků na platformě Illumina HiSeq 2500 k výrobě 250 bp párových end.

Čtení párového konce se sloučí pomocí Flash V1.2.7 [21] a filtrování kvality se provádí pomocí potrubí Qiime 1.7 s Python Scripts [22]. Chimérické sekvence byly odstraněny Uchime [23]. Zpracované čtení (efektivní značky) jsou seskupeny do operačních taxonomických jednotek (OTU) při 97% sekvenční identitě pomocí UParse [24] a taxonomická klasifikace je přiřazena na základě databáze SILVA [25]. Pro posouzení fylogenetických vztahů různých OTU se provádí více sekvenčních zarovnání pomocí Pynast V1.2 [26] proti databázi SILVA a fylogenetický strom byl konstruován pomocí Fasttree [27].

Diverzita alfa je odhadnuta druhovou bohatostí pomocí indexu Chao1 na úrovni OTU. Křivka vzácnosti je generována náhodným výběrem podskupiny sekvenčních dat z každého vzorku, aby představovala počet pozorovaných druhů, a křivka akumulace druhů je vynesena, aby ukázala výskyt nového OTU (druhu) s nepřetržitým vzorkováním. Pro beta rozmanitost se Bray-Curtis rozdíly na úrovni OTU vypočítá a analyzovány pomocí veganského balíčku [28]. Hlavní souřadnicová analýza (PCOA) se provádí na základě vzdáleností Bray-Curtis a vážené i nevážené parametry UNIFRAC [29] se počítají pomocí potrubí Qiime. Ne metrické rozměrové škálování (NMD) se provádí pomocí analýzy vážené korelační sítě (WGCNA), STAT a GGPLOT2 balíčky v R transformací vzdálenosti vážených a nevážených parametrů UNIFRAC do nové sady ortogonálních osí. Všechny analýzy jsou prováděny pomocí interních R skriptů, pokud není uvedeno jinak.

Funkční složení metagenomů je předpovězeno z dat 16S rRNA pomocí softwaru Picrust s skripty Python [30]. Pro predikci genu se používá pro predikci genu, založená na databázi IMG [32], předpokládaná tabulka čísel genových kopií pro každou rodinu genu ze sekvenovaných bakteriálních a archaálních genomů.