Assoziation zwischen fäkalen Mikrobiota -Zusammensetzung, Metabolitenkonzentrationen und Indoxylsulfatspiegeln

Patienten und Studiendesign

Sechzig HD -Patienten werden von der Dialyseeinheit, der Nierenabteilung des Taichung Metroharbour -Krankenhauses von Tunges Tung von Tungs eingeschlossen. Die schriftliche Einverständniserklärung zur Teilnahme an der Studie erfolgt von jedem Teilnehmer, nachdem sie über das Studiendesign und die Ziele informiert wurden. Das experimentelle Protokoll wird an die ethischen Ausschüsse der IRB zur Genehmigung senden. Die Einschlusskriterien sind 18- bis 80 Jahre alt und diagnostiziert mit CKD-Stufe V (derzeit erhalten die Hämodialyse-Behandlung> 3 Monate). Ausschlusskriterien umfassten schwangere oder stillende Frauen; Patienten mit Nierentransplantation, schweren Infektionen, schweren Herzerkrankungen und Lebererkrankungen, Malignität, Autoimmunerkrankungen, schwerer Unterernährung; konsumierte jede Art von Vor- oder Probiotika oder ließ innerhalb von 1 Monat nach dem Beginn der Studie eine Antibiotikatherapie aufgenommen; diagnostiziertes Reizdarmsyndrom, Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa; Darmstrahlung erhalten oder erhalten oder eine große Darmresektion hatten. Die Teilnehmer erhalten eine Ernährungsanweisungen und werden ermutigt, eine stabile Ernährungsaufnahme aufrechtzuerhalten, die durch Ernährungsfragebögen während Patienteninterviews quantifiziert wird. Die Fragebögen sammelten Informationen über die wöchentliche Menge und Häufigkeit des Verbrauchs von Lebensmitteln und Getränken. Daten zur Nährstoffzusammensetzung der verschiedenen Lebensmittel werden unter Verwendung der Tabellen des Instituts für Ernährung und Lebensmittelsicherheit der National Taiwan University erhalten.

Probensammlung, Herstellung und Analyse Blutproben werden getrennt von jedem Teilnehmer entnommen. Blutproben werden nach einer Fastenperiode von 8 bis 12 Stunden unter Verwendung von Natriumfluoridröhrchen gesammelt und bis zur Übertragung in das Forschungslabor auf Eis gehalten. Dort werden die Proben 15 Minuten bei 4 ° C bei 3.000 × g zentrifugiert. Das Serum wird dann in sterile Röhrchen überführt und zur zukünftigen Analyse bei -20 ° C gelagert.

Wir messen die Serumspiegel von Acetat, Propionat, Butyrat und Valerat zusammen mit verzweigten Ketten-SCFAs wie Isobutyrat und Isovalate. Diese Metabolitenprofile werden unter Verwendung von Ultraperformance-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (Ultraperformance-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie) analysiert. Kurz gesagt, 100 & mgr; l jeder Serumprobe werden in 1,5-ml-Mikrotöhren mit 20 mg NaCl, 10 mg Zitronensäure, 20 μl 1 M HCl und 100 & mgr; l Butanol gemischt. Die Mischung ist 2 Minuten lang verwirbelt und dann 15 Minuten bei 18.000 × g zentrifugiert. Der resultierende Überstand wird zur Analyse auf frische Mikrotubs übertragen.

Messung von urämischen Toxinen Wir messen den gesamten urämischen Toxinspiegel und nicht die freien Werte. Die Konzentrationen von Gesamtindoxylsulfat, p-Cresylsulfat, Indol-3-Essigsäure (IAA) und Hippursäure werden unter Verwendung eines zuvor beschriebenen Verfahrens zentral quantifiziert [19]. Kurz gesagt, für die Bindungswettbewerbe, 200 μl Serum, zu dem wir 20 μl 0,50 mm 1-Naphthalenesulfonsäure (interner Standard) hinzugefügt haben, wurde mit 250 & mgr; l 0,24 m Natriumoktanoat (Bindungskonkurrent) mit 250 μl Natrium-Oktanoat (Bindungskonkurrent) gemischt. Nach Wirbelmischung und Zentrifugierung bei 4 ° C, 1860 × g für 20 Minuten, wurde der Überstand auf 12 mm × 100 mm übertragen, GL 14-Glas-Testrohre und 2 ml Dichlormethan zugesetzt. Nach der Wirbelmischung und Zentrifugierung bei 4 ° C wurden 1860 × g für 10 min, 200 & mgr; l der oberen Schicht in Glasautosampler-Fläschchen übertragen, gefolgt von Zugabe von 20 μl 1 m HCl und 15 μl in die HPLC injiziert. Die HPLC -Analyse wurde an einem Agilent 1100 LC (Santa Clara, CA) durchgeführt, und für die chromatographische Analyse wurden Agilent Chemstations -Software verwendet. Die Trennung wurde an einer Zorbax SB-C18 Solv Saver plus HPLC-Säule (5 μm, 3,0 mm × 150 mm) durchgeführt. Eine Durchflussrate von 0,6 ml/min. Die mobile Phase A beträgt 0,2% Trifluoressigsäure in Milli-Q-Wasser und die mobile Phase B beträgt 0,2% Trifluoressigsäure in Acetonitril. Die analytische Methode besteht aus einem isokratischen Lauf mit 92% mobiler Phase A für 23 Minuten. Auf jeden analytischen Lauf folgte ein 1,3 -minütiger Auswaschgradienten auf 100% B. Säulentemperatur 25 ° C und die Autosampler -Tabletttemperatur 6 ° C. Wir haben die Analyten unter Verwendung des Analyt-zu-Standard-Peakflächenverhältnisses auf einem Agilent 1100 Hochleistungs-Fluoreszenzdetektor G1321A und agilentem UV-sichtbaren Detektoren der UV-Serie G1314A mit 1100 Serien quantifiziert. Die Detektoreinstellungen waren λex 260 nm/λem288nm für p-Cresylsulfat und λex 280 nm/λEM 390 nm für Indoxylsulfat, Indol-3-Esakesäure und interner Standard. Hippursäure wurde vom UV-Vis-Detektor bei 254 nm überwacht. Quantitative Ergebnisse werden in Bezug auf ihre Konzentrationen (mg/l) erhalten und berechnet.

Qualifizierte Stuhlproben mit mikrobiota -Profilprobenproben werden in sterilen gefrorenen Röhrchen von Probanden selbst gesammelt und wurden sofort in das Labor transportiert, wo sie für weitere Tests bei -80 ° C gelagert wurden.

DNA -Extraktion und Sequenzierung genomischer DNA aus Fäkalienproben werden unter Verwendung des Qiagen -DNA -Stuhls Fast Kit (QIAGEN) gemäß den Richtlinien des Herstellers extrahiert. Die Qualität der extrahierten metagenomischen DNA wird durch 1,0% Agarosegelelektrophorese und spektrophotometrische Analyse (Messung der optischen Dichte bei einem Verhältnis von 260/280 nm) bewertet. Damit die extrahierte DNA als geeignet angesehen werden soll, muss die Konzentration 20 ng/μl mit einem Verhältnis von 260/280 nm innerhalb des Bereichs von 1,8 bis 2,0 überschreiten. Die variable Region 4 (V4) des bakteriellen 16S -rRNA -Gens wird durch Polymerasekettenreaktion (PCR) mit bakteriellen/archaalen Primern 515F/806R amplifiziert, einschließlich Barcodes zur Probenidentifizierung [20]. Die resultierenden Amplikons werden unter Verwendung des Genjet -Gelextraktionskits (Thermo Scientific) gereinigt und mit einem Qubit -DSDNA -HS -Assay -Kit auf einem Qubit 2.0 -Fluorometer (Qubit) quantifiziert. Sequenzbibliotheken werden unter Verwendung des Nebnext® Ultra ™ DNA -Bibliotheksvorbereitungskits für Illumina (NEB) nach dem Protokoll des Herstellers hergestellt. Die gereinigten Bibliotheken werden quantifiziert, normalisiert, gepoolt und dann für die Clustererzeugung und -sequenzierung auf einer Illumina-Hiseq 2500-Plattform verwendet, um 250 BP-Paired-End-Lesevorgänge zu produzieren.

Paired-End-Lesevorgänge werden mit Flash v1.2.7 [21] zusammengeführt, und die Qualitätsfilterung wird unter Verwendung der Qiime 1.7-Pipeline mit Python-Skripten [22] durchgeführt. Chimäre Sequenzen wurden von Uchime entfernt [23]. Die verarbeiteten Lesevorgänge (effektive Tags) werden mit einer Sequenzidentität von 97% unter Verwendung von uparse [24] in operative taxonomische Einheiten (OTUs) eingeteilt, und die taxonomische Klassifizierung wird basierend auf der SILVA -Datenbank [25] zugewiesen. Um die phylogenetischen Beziehungen verschiedener OTUs zu bewerten, werden mehrere Sequenzausrichtungen mit Pynast v1.2 [26] gegen die Silva -Datenbank durchgeführt, und ein phylogenetischer Baum wurde unter Verwendung von Fastree [27] konstruiert.

Die Alpha -Vielfalt wird nach dem Artenreichtum unter Verwendung des ChaO1 -Index auf OTU -Ebene geschätzt. Eine Verdünnungskurve wird erzeugt, indem zufällig eine Untergruppe von Sequenzierungsdaten aus jeder Probe ausgewählt wird, um die Anzahl der beobachteten Spezies darzustellen, und eine Speziesakkumulationskurve wird aufgetragen, um das Auftreten von neuem OTUs (Spezies) mit kontinuierlicher Probenahme zu zeigen. Für die Beta-Diversität werden Bray-Curtis-Unähnlichkeiten auf OTU-Ebene mit dem veganen Paket berechnet und analysiert [28]. Die Hauptkoordinatenanalyse (PCOA) wird basierend auf Bray-Curtis-Entfernungen durchgeführt, und sowohl gewichtete als auch ungewichtete UNIFRAC-Parameter [29] werden über die Qiime-Pipeline berechnet. Die nicht-metrische dimensionale Skalierung (NMDS) wird unter Verwendung der gewichteten Korrelationsnetzwerkanalyse (WGCNA), STAT und GGPLOT2-Pakete in R durchgeführt, indem eine Entfernungsmatrix gewichteter und ungewichteter UNIFRAC-Parameter in einen neuen Satz von orthoogonalen Achsen umgewandelt wird. Alle Analysen werden unter Verwendung interner R-Skripte durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.

Die funktionelle Zusammensetzung von Metagenomen wird aus 16S -rRNA -Daten unter Verwendung der Picrust -Software mit Python -Skripten vorhergesagt [30]. Eine vorkundige Tabelle der Genkopienzahlen für jede Genfamilie aus sequenzierten bakteriellen und archaalen Genomen, basierend auf der IMG -Datenbank [32], wird zusammen mit einem phylogenetischen Baum aus der Greengenes -Datenbank [32] zur Vorhersage der Geninhalte verwendet.