Exprese IL-15 a jeho receptoru v Decidua

Exprese IL-15 a IL-15Rα v lymfocytech periferní krve a decidua během časného těhotenství

1. Odběr vzorků Odeberte periferní krev a decidální tkáň od 20-30 těhotných žen ve věku 6-8 týdnů gestačního věku během D&C procedury kvůli multiparitě.
2. Imunohistochemické barvení deciduální tkáně Zmražený řez deciduální tkáně byl proveden podle doporučených postupů. Postupně byly přidány první protilátka, myší anti-lidská IL-15 nebo IL-15Ra monoklonální protilátka, druhá protilátka, kozí anti-myší polyklonální protilátka značená peroxidázou a barevná činidla. Nakonec byla sklíčka kontrastně obarvena hematoxylinem.
3. Separace mononukleárních buněk Vzorky decidivní tkáně a periferní krve byly odebrány každé těhotné ženě v době potratu. Aby se minimalizovala kontaminace krví, byla deciduální tkáň makroskopicky oddělena od choriových klků, dvakrát promyta Hankovým vyváženým solným roztokem, nakrájena na malé kousky, znovu dvakrát promyta a protlačena přes 1,9 mm síťku, aby se odstranila zbytková krev bez enzymatické ošetření. Tyto vzorky byly poté filtrovány přes 45,7 μm síťku z nerezové oceli, aby se odstranily zbytky tkáně. Filtrovaný roztok byl převrstven přes gradient Ficoll-Paque PLUS a centrifugován po dobu 45 minut při 400 g. Obohacená buněčná suspenze mononukleárních buněk byla shromážděna na rozhraní a poté dvakrát promyta médiem RPMI-1640. Mononukleární buňky periferní krve byly také izolovány sedimentací Ficoll-Paque PLUS.
4. Cytometrické analýzy Exprese intracelulárního IL-15 a povrchového IL-15Ra v mononukleárních buňkách byla analyzována průtokovou cytometrií. Kombinace protilátek zahrnovaly: FITC/PE/PerCP-CD4/IL-15/CD3, CD8/IL-15/CD3, CD56/IL-15/CD3, CD4/IL-15Ra/CD3, CD8/IL-15Ra/CD3 CD56/IL-15Ra/CD3.
5. Separace CD4+ buněk, CD8+ buněk a NK buněk CD4+ buňky, CD8+ buňky a NK buňky v periferní krvi a deciduae byly separovány pomocí magneticky aktivovaného třídiče buněk (MACS).
6. PCR v reálném čase IL-15 a IL-15Ra mRNA Celková RNA v CD4+ buňkách, CD8+ buňkách a NK buňkách byla extrahována pomocí Trizol a byla transformována na cDNA s reverzní transkripcí. PCR v reálném čase byla provedena s použitím různých sond pro ß-aktin, IL-15 a IL-15Rα se systémem ABI PRISM 7700 Sequence Detector System. Sekvence primerů byly: ß-aktin, 5' GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA; 5' CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC; IL-15, 5' GGC TTT GAG TAA TGA GAA TTT CGA; 5' ATC AAT TGC AAT CAA GAA GTG TTG; IL-15Ra, 5' GGC GAC GCG GGG CAT CAC; 5' TCG CTG TGG CCC TGT GGA TA.

7. Funkční testy CD4+ buněk, CD8+ buněk a NK buněk

   1. Proliferační test Pomocí inkorporace BrdU během buněčné proliferace byla hodnocena proliferační schopnost CD4+ buněk, CD8+ buněk a NK buněk, když byly přidány různé koncentrace IL-15 a IL-2.
   2. Test sekrece Koncentrace IFN-y, IL-6 a IL-10 v supernatantu byly detekovány pomocí souprav ELISA, když byly do kultivačního média přidány různé koncentrace IL-15 a IL-2.
   3. Buněčná cytotoxicita založená na fluorescenci – FCC test Cytolýza cílových buněk zprostředkovaná NK a CTL představuje formu apoptózy a je doprovázena mnoha stejnými jevy, včetně aktivace kaspázy. Fluorogenní substrát pro kaspázu 6 jsme začlenili do cílových buněk (buňky K562 a autologní cytotrofoblasty) a měřili aktivaci kaspázy detekcí fluorescence emitované ze štěpeného substrátu.

Exprese IL-15 a IL-15Rα v lidském embryu před a po společné kultivaci s autologním endometriem

1. Imunocytochemické barvení lidského embrya Lidská embrya z IVF programu byla fixována na adhezní sklíčko pomocí ledově chladného fixačního pufru. Byla přidána monoklonální protilátka anti-IL-15 konjugovaná s fykoerythrinem nebo biotinylovaná protilátka proti lidskému IL-15Ra a konjugát streptavidin-fluorescein isothiokyanát (SAv-FITC). Fluoroskop byl použit k detekci fluorescence emitované z cílů.
2. Jednobuněčná PCR mRNA IL-15 a IL-15Rα Použitím principu „zachycení biotinu/streptavidinu“ byla mRNA embrya izolována pomocí Micro RNA Isolation Kit, značena biotinem značenou oligo dT-sondou a extrahována streptavidinem potaženým trubky. Po transformaci na cDNA byla provedena PCR v reálném čase za použití různých sond pro ß-aktin, IL-15 a IL-15Ra se systémem ABI PRISM 7700 sekvenčním detektorem, jak je popsáno výše.
3. Separace autologních endometriálních buněk Biopsie endometria v luteální fázi byla provedena v cyklu před IVF procedurou pacientky pomocí Pipelle Endometrial Suction Curette. Tkáň byla štěpena 0,2% kolagenázou typu 2 a ponechána usadit se diferenciální sedimentací při jednotkové gravitaci. Výše uvedené kroky byly opakovány čtyřikrát a byl odebrán supernatant. Po diferenciální sedimentaci při jednotkové gravitaci byl supernatant obsahující frakci obohacenou stromatem převeden do lahví pro tkáňové kultury pro budoucí použití. Kousky tkáně, které zůstaly po čtyřech štěpení, byly resuspendovány v 10 ml HBSS. Po přibližně 30 sekundách se horních 8 ml nechalo usadit při jednotkové gravitaci. Tato sedimentace obsahující frakci obohacenou žlázami byla resuspendována v RPMI a nanesena do lahví pro tkáňové kultury pro budoucí kokultivaci.
4. Autologní kokultivace endometria lidského embrya Odhadovaný den před podáním hCG během IVF cyklu pacientky bylo smícháno přibližně stejné množství glandulárních a stromálních buněk. Přibližně 3x10^5 buněk bylo nasazeno do čtyřjamkové destičky pro tkáňové kultury a zygoty byly umístěny do kokultivačního systému nebo konvenčního média (lidská tubární tekutina plus 15% mateřské sérum). Rychlost štěpení a morfologický vzhled byly hodnoceny denně. Morfologicky nejlepší embrya byla přenesena zpět pacientovi 72 hodin po odběru bez ohledu na kultivační systém. Rychlost implantace byla definována jako počet intrauterinních váčků s fetální srdeční aktivitou na počet přenesených embryí. Klinická těhotenství zahrnovala pouze těhotenství se srdečním tepem plodu dokumentovaným na transvaginálním ultrazvuku do 49. dne.
5. Distribuce cytokinů v kokultivačním médiu Cytokiny, včetně Th1 cytokinů (IL-2 a IFN-γ), Th2 cytokinů (IL-4, IL-6 a IL-10) a IL-15 byly stanoveny technikou ELISA v kokultivační médium před a po nanesení embryí.
6. Imunocytochemické barvení žlázových a stromálních buněk lidské endometria Purifikované žlázové a stromální buňky endometria byly dvakrát promyty studeným promývacím pufrem, aby se odstranily cytokiny přilnuté na buňkách. Tyto buňky byly poté fixovány na adhezní sklíčko pomocí ledově chladného fixačního pufru. Byla přidána monoklonální protilátka anti-IL-15 konjugovaná s fykoerythrinem nebo biotinylovaná protilátka proti lidskému IL-15Ra a konjugát streptavidin-fluorescein isothiokyanát (SAv-FITC). Fluoroskop byl použit k detekci fluorescence emitované z cílů.
7. PCR v reálném čase IL-15 a IL-15Ra mRNA z lidských žlázových a stromálních buněk endometria Celková RNA v žlázových a stromálních buňkách endometria byla extrahována pomocí Trizolu a transformována na cDNA s reverzní transkripcí. PCR v reálném čase byla provedena s použitím různých sond pro ß-aktin, IL-15 a IL-15Ra se systémem ABI PRISM 7700 sekvenčním detektorem, jak je popsáno výše.