Uttrycket av IL-15 och dess receptor i Decidua

Uttrycket av IL-15 och IL-15Ra i lymfocyterna i perifert blod och decidua under tidig graviditet

1. Samling av prov Samla in det perifera blodet och decidualvävnaden från 20-30 gravida kvinnor i 6-8 veckors graviditetsålder under D&C-proceduren på grund av multiparitet.
2. Immunhistokemisk färgning av decidualvävnad Den frusna delen av decidualvävnad utfördes enligt rekommenderade procedurer. Första antikropp, mus anti-human IL-15 eller IL-15Ra monoklonal antikropp, andra antikropp, peroxidasmärkt get-anti-mus polyklonal antikropp och färgreagens tillsattes sekventiellt. Slutligen motfärgades objektglasen med hematoxylin.
3. Separation av mononukleära celler Decidualvävnads- och perifera blodprover togs från varje gravid kvinna vid tidpunkten för aborten. För att minimera kontaminering av blod separerades decidualvävnaden makroskopiskt från chorionvilli, tvättades två gånger med Hanks balanserade saltlösning, skars i små bitar, tvättades två gånger igen och passerades genom en 1,9 mm maskvidd för att avlägsna restblodet utan enzymatisk behandling. Dessa prover filtrerades sedan genom ett 45,7 μm rostfritt stålnät för att avlägsna vävnadsrester. Den filtrerade lösningen skiktades över en Ficoll-Paque PLUS-gradient och centrifugerades i 45 minuter vid 400 g. En berikad cellsuspension av mononukleära celler uppsamlades vid gränsytan och tvättades sedan två gånger med RPMI-1640-medium. Perifera mononukleära blodceller isolerades också genom Ficoll-Paque PLUS-sedimentering.
4. Cytometriska analyser Uttrycket av intracellulärt IL-15 och yt-IL-15Ra i mononukleära celler analyserades med flödescytometri. Antikroppskombinationerna inkluderade: FITC/PE/PerCP-CD4/IL-15/CD3, CD8/IL-15/CD3, CD56/IL-15/CD3, CD4/IL-15Ra/CD3, CD8/IL-15Ra/CD3 CD56/IL-15Ra/CD3.
5. Separation av CD4+-celler, CD8+-celler och NK-celler CD4+-cellerna, CD8+-cellerna och NK-cellerna i perifert blod och deciduae separerades med magnetisk aktiverad cellsorterare (MACS).
6. Realtids-PCR av IL-15 och IL-15Ra-mRNA Det totala RNA:t i CD4+-celler, CD8+-celler och NK-celler extraherades med Trizol och transformerades till cDNA med omvänd transkription. Realtids-PCR utfördes med användning av olika prober för ß-aktin, IL-15 och IL-15Ra med ABI PRISM 7700 Sequence Detector System. Primersekvenserna var: ß-aktin, 5' GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA; 5' CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC; IL-15, 5' GGC TTT GAG TAA TGA GAA TTT CGA; 5' ATC AAT TGC AAT CAA GAA GTG TTG; IL-15Ra, 5' GGC GAC GCG GGG CAT CAC; 5' TCG CTG TGG CCC TGT GGA TA.

7. Funktionstester av CD4+-celler, CD8+-celler och NK-celler

   1. Proliferativ analys Genom att använda inkorporering av BrdU under cellulär proliferation utvärderades den proliferativa förmågan hos CD4+-celler, CD8+-celler och NK-celler när olika koncentrationer av IL-15 och IL-2 tillsattes.
   2. Sekretionsanalys Koncentrationerna av IFN-y, IL-6 och IL-10 i supernatanten detekterades med användning av ELISA-kit när olika koncentrationer av IL-15 och IL-2 tillsattes i odlingsmediet.
   3. Fluoresensbaserad cellulär cytotoxicitet- FCC-analys NK- och CTL-medierad cytolys av målceller utgör en form av apoptos och åtföljs av många av samma händelser, inklusive kaspasaktivering. Vi införlivade det fluorogena substratet för kaspas 6 i målcellerna (K562-celler och autologa cytotrofoblaster) och mätte kaspasaktiveringen genom att detektera fluorescensen som emitteras från det kluvna substratet.

Uttrycket av IL-15 och IL-15Ra i det mänskliga embryot före och efter samodlade med autologt endometrium

1. Immunocytokemisk färgning av mänskligt embryo Mänskliga embryon från IVF-program fixerades på vidhäftningsglaset med iskall fixeringsbuffert. Den fykoerytrin-konjugerade anti-IL-15 monoklonala antikroppen eller biotinylerad anti-human IL-15Ra-antikropp och streptavidin-fluorescein isotiocyanat (SAv-FITC) konjugat tillsattes. Fluoroskopet användes för att detektera fluorescensen som emitterades från målen.
2. Encellig PCR av IL-15 och IL-15Ra mRNA Med användning av principen om biotin/streptavidin "infångning" isolerades embryot mRNA med Micro RNA Isolation Kit, märktes med biotinmärkt oligo dT-sond och extraherades med streptavidin-belagd rör. Efter transformering till cDNA utfördes realtids-PCR med användning av olika prober för ß-aktin, IL-15 och IL-15Ra med ABI PRISM 7700 Sequence Detector System, som beskrivits ovan.
3. Separation av autologa endometrieceller En lutealfas endometriebiopsi utfördes i en cykel före patientens IVF-procedur med en Pipelle Endometrial Suction Curette. Vävnaden digererades med 0,2 % kollagenas typ 2 och fick sedimentera genom differentiell sedimentering vid enhet gravitation. Ovanstående steg upprepades fyra gånger och supernatanten samlades upp. Efter differentiell sedimentering vid gravitationsenhet överfördes supernatanten, innehållande den stroma-berikade fraktionen, till vävnadsodlingskolvar för framtida användning. Vävnadsbitarna, som fanns kvar efter de fyra digereringarna, återsuspenderades i 10 ml HBSS. Efter ungefär 30 sekunder tilläts de översta 8 ml att sedimentera vid enhet gravitation. Denna sedimentering, innehållande körtelberikad fraktion, återsuspenderades i RPMI och ströks ut i vävnadsodlingsflaskor för framtida samodling.
4. Autolog endometriesamodling av mänskligt embryo Ungefär en lika stor mängd av körtel- och stromacellerna blandades den beräknade dagen före administreringen av hCG under patientens IVF-cykel. Cirka 3x10^5 celler såddes in i en vävnadsodlingsplatta med fyra brunnar och zygoterna placerades i samodlingssystemet eller konventionellt medium (human tubalvätska plus 15% moderserum). Klyvningshastigheter och morfologiskt utseende utvärderades dagligen. De morfologiskt bästa embryona överfördes tillbaka till patienten 72 timmar efter hämtning, oavsett odlingssystem. Implantationshastigheten definierades som antalet intrauterina säckar med fetal hjärtaktivitet per antal överförda embryon. Kliniska graviditeter inkluderade endast de graviditeter med fostrets hjärtslag dokumenterade på transvaginalt ultraljud dag 49.
5. Cytokinfördelningen i samodlingsmedium Cytokinerna, inklusive Th1-cytokiner (IL-2 och IFN-y), Th2-cytokiner (IL-4, IL-6 och IL-10) och IL-15 bestämdes med ELISA-teknik i samodlingsmedium före och efter utsträckta embryon.
6. Immunocytokemisk färgning av humana endometriekörtel- och stromaceller. De renade endometriekörtel- och stromacellerna tvättades två gånger med kall tvättbuffert för att avlägsna cytokinerna vidhäftande på cellerna. Dessa celler fixerades sedan på vidhäftningsglaset med iskall fixeringsbuffert. Den fykoerytrin-konjugerade anti-IL-15 monoklonala antikroppen eller biotinylerad anti-human IL-15Ra-antikropp och streptavidin-fluorescein isotiocyanat (SAv-FITC) konjugat tillsattes. Fluoroskopet användes för att detektera fluorescensen som emitterades från målen.
7. Realtids-PCR av IL-15 och IL-15Ra mRNA från humana endometriekörtel- och stromaceller. Det totala RNA:t i endometriekörtel- och stromaceller extraherades med Trizol och transformerades till cDNA med omvänd transkription. Realtids-PCR utfördes med användning av olika prober för ß-aktin, IL-15 och IL-15Ra med ABI PRISM 7700 Sequence Detector System, som beskrivits ovan.