Ekspresja IL-15 i jej receptora w Decidua

Ekspresja IL-15 i IL-15Rα w limfocytach krwi obwodowej i doczesnej we wczesnej ciąży

1. Pobieranie próbek Pobrać krew obwodową i tkanki szczątkowe od 20-30 ciężarnych w 6-8 tygodniu ciąży podczas procedury D&C ze względu na wielorództwo.
2. Barwienie immunohistochemiczne tkanki martwej Zamrożony skrawek tkanki martwej wykonano zgodnie z zalecanymi procedurami. Kolejno dodawano pierwsze przeciwciało, mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej IL-15 lub IL-15Rα, drugie przeciwciało, znakowane peroksydazą kozie przeciwciało poliklonalne przeciw mysim przeciwciałom i odczynniki barwiące. Na koniec szkiełka barwiono kontrastowo hematoksyliną.
3. Separacja komórek jednojądrzastych Od każdej kobiety ciężarnej w momencie aborcji pobrano próbki tkanek martwych i krwi obwodowej. W celu zminimalizowania kontaminacji krwią tkankę szczątkową oddzielono makroskopowo od kosmków kosmówkowych, przemyto dwukrotnie zbilansowanym roztworem soli Hanka, pocięto na małe kawałki, ponownie przemyto dwukrotnie i przepuszczono przez sito o oczkach 1,9 mm w celu usunięcia resztek krwi bez obróbka enzymatyczna. Próbki te następnie filtrowano przez siatkę ze stali nierdzewnej 45,7 μm w celu usunięcia resztek tkanki. Przesączony roztwór nałożono na gradient Ficoll-Paque PLUS i wirowano przez 45 minut przy 400 g. Wzbogaconą zawiesinę komórek jednojądrzastych zebrano na granicy faz, a następnie przemyto dwukrotnie pożywką RPMI-1640. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej izolowano również przez sedymentację Ficoll-Paque PLUS.
4. Analizy cytometryczne Ekspresję wewnątrzkomórkowej IL-15 i powierzchniowej IL-15Rα w komórkach jednojądrzastych analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Kombinacje przeciwciał obejmowały: FITC/PE/PerCP-CD4/IL-15/CD3, CD8/IL-15/CD3, CD56/IL-15/CD3, CD4/IL-15Rα/CD3, CD8/IL-15Rα/CD3 , CD56/IL-15Rα/CD3.
5. Oddzielanie komórek CD4+, CD8+ i komórek NK Komórki CD4+, komórki CD8+ i komórki NK z krwi obwodowej i dolistnych rozdzielono odpowiednio za pomocą magnetycznie aktywowanego sortera komórek (MACS).
6. PCR w czasie rzeczywistym mRNA IL-15 i IL-15Rα Całkowity RNA w komórkach CD4+, komórkach CD8+ i komórkach NK ekstrahowano Trizolem i transformowano do cDNA z odwrotną transkrypcją. PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono stosując różne sondy dla ß-aktyny, IL-15 i IL-15Rα z systemem ABI PRISM 7700 Sequence Detector System. Sekwencje starterów były następujące: ß-aktyna, 5' GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA; 5' CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC; IL-15, 5' GGC TTT GAG TAA TGA GAA TTT CGA; 5' ATC AAT TGC AAT CAA GAA GTG TTG; IL-15Rα, 5' GGC GAC GCG GGG KOT CAC; 5' TCG CTG TGG CCC TGT GGA TA.

7. Badania funkcjonalne komórek CD4+, CD8+ i komórek NK

   1. Test proliferacyjny Stosując wbudowanie BrdU podczas proliferacji komórkowej, oceniono zdolność proliferacyjną komórek CD4+, komórek CD8+ i komórek NK po dodaniu różnych stężeń IL-15 i IL-2.
   2. Test wydzielania Stężenia IFN-γ, IL-6 i IL-10 w supernatancie wykrywano przy użyciu zestawów ELISA, gdy do pożywki hodowlanej dodawano różne stężenia IL-15 i IL-2.
   3. Cytotoksyczność komórkowa oparta na fluoresencji — test FCC Cytoliza komórek docelowych, w której pośredniczą NK i CTL, stanowi formę apoptozy i towarzyszy jej wiele takich samych zdarzeń, w tym aktywacja kaspazy. Wprowadziliśmy fluorogenny substrat dla kaspazy 6 do komórek docelowych (komórki K562 i autologiczne cytotrofoblasty) i zmierzyliśmy aktywację kaspazy przez wykrywanie fluorescencji emitowanej z rozszczepionego substratu.

Ekspresja IL-15 i IL-15Rα w embrionie ludzkim przed i po współhodowaniu z autologicznym endometrium

1. Barwienie immunocytochemiczne embrionu ludzkiego Embriony ludzkie z programu IVF utrwalono na szkiełku adhezyjnym za pomocą lodowatego buforu Fixation Buffer. Dodano skoniugowane z fikoerytryną przeciwciało monoklonalne anty-IL-15 lub biotynylowane przeciwciało anty-ludzkie IL-15Rα i koniugat streptawidyna-izotiocyjanian fluoresceiny (SAv-FITC). Do wykrywania fluorescencji emitowanej przez cele zastosowano fluoroskop.
2. Jednokomórkowy PCR mRNA IL-15 i IL-15Rα Wykorzystując zasadę „wychwytywania” biotyny/streptawidyny, mRNA zarodka wyizolowano za pomocą zestawu Micro RNA Isolation Kit, wyznakowano znakowaną biotyną sondą oligo dT i wyekstrahowano powleczoną streptawidyną rury. Po transformacji do cDNA przeprowadzono PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu różnych sond dla ß-aktyny, IL-15 i IL-15Rα z systemem wykrywania sekwencji ABI PRISM 7700, jak opisano powyżej.
3. Separacja autologicznych komórek endometrium Biopsję endometrium fazy lutealnej wykonano w cyklu przed zabiegiem IVF pacjentki przy użyciu kirety ssącej Pipelle Endometrium. Tkankę trawiono 0,2% kolagenazą typu 2 i pozostawiono do osadzenia przez różnicową sedymentację przy ciężarze jednostkowym. Powyższe etapy powtórzono czterokrotnie i zebrano supernatant. Po zróżnicowanej sedymentacji przy ciężarze jednostkowym supernatant zawierający frakcję wzbogaconą w zrąb przeniesiono do kolb do hodowli tkankowych do wykorzystania w przyszłości. Kawałki tkanki, które pozostały po czterech trawieniach, ponownie zawieszono w 10 ml HBSS. Po około 30 sekundach górne 8 ml pozostawiono do osadzenia przy ciężarze jednostkowym. Tę sedymentację, zawierającą frakcję wzbogaconą w gruczoły, ponownie zawieszono w RPMI i wysiano do kolb do hodowli tkankowych do przyszłej wspólnej hodowli.
4. Wspólna hodowla autologicznego endometrium ludzkiego zarodka W przybliżeniu równe ilości komórek gruczołowych i zrębowych zmieszano szacowanego dnia przed podaniem hCG podczas cyklu IVF pacjentki. Około 3x10^5 komórek wysiano na czterostudzienkową płytkę do hodowli tkankowej, a zygoty umieszczono w systemie wspólnej hodowli lub konwencjonalnej pożywce (ludzki płyn jajowodowy plus 15% surowica matki). Szybkość rozszczepiania i wygląd morfologiczny oceniano codziennie. Morfologicznie najlepsze zarodki przenoszono z powrotem do pacjenta 72 godziny po pobraniu, niezależnie od systemu hodowli. Szybkość implantacji zdefiniowano jako liczbę pęcherzyków wewnątrzmacicznych z czynnością serca płodu na liczbę przeniesionych zarodków. Ciąże kliniczne obejmowały tylko ciąże z biciem serca płodu udokumentowanym na USG przezpochwowym do 49 dnia.
5. Dystrybucja cytokin w pożywce do wspólnej hodowli Cytokiny, w tym cytokiny Th1 (IL-2 i IFN-γ), cytokiny Th2 (IL-4, IL-6 i IL-10) oraz IL-15 oznaczono techniką ELISA w podłoże do wspólnej hodowli przed i po wysianiu zarodków.
6. Barwienie immunocytochemiczne ludzkich komórek gruczołowych i zrębowych endometrium Oczyszczone komórki gruczołowe i zrębowe endometrium przemyto dwukrotnie zimnym buforem płuczącym w celu usunięcia przylegających do komórek cytokin. Komórki te następnie utrwalono na szkiełku adhezyjnym za pomocą lodowatego buforu utrwalającego. Dodano skoniugowane z fikoerytryną przeciwciało monoklonalne anty-IL-15 lub biotynylowane przeciwciało anty-ludzkie IL-15Rα i koniugat streptawidyna-izotiocyjanian fluoresceiny (SAv-FITC). Do wykrywania fluorescencji emitowanej przez cele zastosowano fluoroskop.
7. PCR w czasie rzeczywistym mRNA IL-15 i IL-15Rα z ludzkich komórek gruczołowych i zrębowych endometrium Całkowity RNA w komórkach gruczołowych i zrębowych endometrium ekstrahowano Trizolem i transformowano do cDNA z odwrotną transkrypcją. PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono stosując różne sondy dla β-aktyny, IL-15 i IL-15Rα z systemem wykrywania sekwencji ABI PRISM 7700, jak opisano powyżej.